Ein männliches Steroid kontrolliert das weibliche Sexualverhalten bei der Malariamücke

Nature Band 608, Seiten 93–97 (2022)Diesen Artikel zitieren

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Es wird allgemein angenommen, dass Insekten im Gegensatz zu Wirbeltieren keine männlich geprägten Sexualsteroidhormone haben1. In der Malariamücke Anopheles gambiae scheint sich das Ecdysteroid 20-Hydroxyecdyson (20E) entwickelt zu haben, um sowohl die Eientwicklung zu kontrollieren, wenn es von Weibchen synthetisiert wird2, als auch die Paarungsresistenz zu induzieren, wenn es von Männchen sexuell übertragen wird3. Da die Entwicklung und Paarung von Eiern wesentliche Fortpflanzungsmerkmale sind, kann das Verständnis, wie Anopheles-Weibchen diese hormonellen Signale integrieren, die Entwicklung neuer Programme zur Malariabekämpfung vorantreiben. Hier zeigen wir, dass diese Fortpflanzungsfunktionen durch bestimmte Sexualsteroide über ein ausgeklügeltes Netzwerk von Ecdysteroid-aktivierenden/inaktivierenden Enzymen reguliert werden. Wir identifizieren ein männerspezifisches oxidiertes Ecdysteroid, 3-Dehydro-20E (3D20E), das die Vaterschaft schützt, indem es die weibliche sexuelle Empfänglichkeit nach seiner sexuellen Übertragung und Aktivierung durch Dephosphorylierung ausschaltet. Bemerkenswert ist, dass der 3D20E-Transfer auch die Expression eines Fortpflanzungsgens induziert, das die Eientwicklung während einer Plasmodium-Infektion aufrechterhält und so die Fitness infizierter Weibchen sicherstellt. Von Frauen stammendes 20E löst keine sexuelle Widerwilligkeit aus, sondern ermöglicht stattdessen die Eiablage bei begatteten Individuen, sobald eine 20E-hemmende Kinase unterdrückt wird. Die Identifizierung dieses männlich-spezifischen Insektensteroidhormons und seiner Rolle bei der Regulierung der sexuellen Empfänglichkeit, Fruchtbarkeit und Wechselwirkungen mit Plasmodium-Parasiten legt die Möglichkeit nahe, den Fortpflanzungserfolg von Malaria übertragenden Mücken zu verringern.

Malariafälle und Todesfälle nehmen erneut zu4, was auf mehrere Faktoren zurückzuführen ist, darunter die weit verbreitete Insektizidresistenz bei Anopheles-Mücken, die die einzigen Überträger für menschliche Malariaparasiten sind. Die Paarungsbiologie dieser Mücken ist ein besonders attraktives Ziel für neuartige Interventionen zur Malariabekämpfung, da sich die Weibchen nur einmal paaren5; Die Sterilisierung dieses einzelnen Paarungsereignisses hätte ein enormes Potenzial für die Reduzierung der Feldmückenpopulationen.

Frauen verlieren ihre sexuelle Empfänglichkeit, nachdem sie von Männern hohe Steroidhormonspiegel erhalten haben. Studien deuten darauf hin, dass der Auslöser der Weigerung gegenüber einer weiteren Paarung 20-Hydroxyecdyson (20E)3 ist, ein Steroidhormon, das besser als Regulator der Häutungszyklen im Larvenstadium bekannt ist6. Die Fähigkeit von Männern, 20E zu synthetisieren und zu übertragen, hat sich speziell in einer Untergruppe von Anopheles-Arten aus der Untergattung Cellia7 entwickelt, die Afrika bevölkert und die gefährlichsten Malariaüberträger umfasst, darunter Anopheles gambiae5. Dies ist besonders bemerkenswert, da bei diesen Arten 20E auch von den Weibchen nach jeder Blutmahlzeit produziert wird, wodurch 20E die oogenetischen Zyklen steuert (siehe Lit. 8). Allerdings ist die Art und Weise, wie Weibchen Signale integrieren, die von zwei verschiedenen Ecdysteroid-Quellen stammen (Männchen übertragen und durch Bluternährung induziert), ohne ihre eigene Fähigkeit zur Paarung zu beeinträchtigen, kaum verstanden. Würde das von Frauen produzierte 20E die sexuelle Widerspenstigkeit auslösen, würde dies tatsächlich zu Unfruchtbarkeit bei Individuen führen, die sich als Jungfrauen von Blut ernähren, was bei diesen Mücken ein sehr häufiges Verhalten ist5.

Eine mögliche Erklärung ist, dass A. gambiae-Männchen ein modifiziertes, männerspezifisches Ecdysteroid übertragen, das Signalkaskaden im weiblichen Fortpflanzungstrakt aktiviert, was zu einer Paarungsunfähigkeit führt. Während Wirbeltiere über mehrere Klassen weitgehend dimorpher Steroidhormone wie Östrogene und Androgene verfügen (Übersicht in Lit. 9), wurden bei Insekten unseres Wissens keine männlich beeinflussten Steroide identifiziert.

Unser Ziel war es, die vollständige Zusammensetzung der Steroidhormone in den männlichen Nebendrüsen (MAGs) geschlechtsreifer A. gambiae-Männchen zu bestimmen und nach möglichen modifizierten Steroiden zu suchen. Mithilfe von Hochleistungsflüssigkeitschromatographie gekoppelt mit Tandem-Massenspektrometrie (HPLC-MS/MS) anstelle der zuvor verwendeten weniger spezifischen Methoden7,10,11 konnten wir Ecdyson (E) und 20E in diesem Gewebe nachweisen und damit frühere Ergebnisse bestätigen. In den Proben dominierte jedoch ein oxidiertes, phosphoryliertes Steroid, das der chemischen Formel 3-Dehydro-20E-22-phosphat (3D20E22P)12 entsprach (Abb. 1). Andere Formen umfassten 3-Dehydro-20E (3D20E) und 20E-22-Phosphat (20E22P). Die HPLC-MS/MS-Signalintensität von 3D20E22P war zwei Größenordnungen höher als die seiner dephosphorylierten Form 3D20E und drei Größenordnungen höher als die von E und 20E (Abb. 1). Bei bluternährten Weibchen wurden keine nachweisbaren Konzentrationen von 3D20E22P oder 3D20E gefunden, obwohl E und 20E (und niedrige Konzentrationen von 20E22P) erwartungsgemäß11 im Rest des Körpers und im unteren Fortpflanzungstrakt (LRT; Extended Data Abb.) nachgewiesen wurden . 1a). Wir haben auch Ecdysteroide bei neu geschlüpften (<1 Tag alten) Männern und Frauen profiliert und 3D20E und 3D20E22P nur in den MAGs nachgewiesen; E, 20E und 20E22P waren bei beiden Geschlechtern vorhanden (Extended Data Abb. 1b). Diese Daten zeigen, dass erwachsene Männchen von A. gambiae in ihren MAGs hohe Titer an veränderten Hormonen produzieren, die von Weibchen nicht synthetisiert werden.

MAGs und weibliche LRTs (einschließlich Atrium, Spermatheca und Parovarium) wurden von 4 Tage alten (4 Tagen) jungfräulichen Männchen sowie von jungfräulichen und begatteten Weibchen (bei 0,5, 3 und 12 hpm) präpariert. Ecdysteroide in diesen Geweben wurden mittels HPLC-MS/MS analysiert (Mittelwert ± Standardabweichung; ungepaarter t-Test, zweiseitig, Falscherkennungsrate (FDR) korrigiert; NS, nicht signifikant; *P < 0,05, **P < 0,01 . 3D20E: 3 Stunden gegenüber 0,5 Stunden, P = 0,035; 12 Stunden gegenüber 3 Stunden, P = 0,0015; 12 Stunden gegenüber 0,5 Stunden, P = 0,030. 3D20E22P: 3 Stunden gegenüber 0,5 Stunden, P = 0,25; 12 Stunden gegenüber 3 Stunden , P = 0,0032; 12 h versus 0,5 h, P = 0,015). Die Daten von drei biologischen Replikaten wurden gepoolt. Die Peakfläche wurde für jedes interessierende Ecdysteroid berechnet und anhand der Mückenzahlen normalisiert. Ecdysteroide werden farblich wie folgt angezeigt: E, grün; 20E, orange; 20E22P, lila; 3D20E, blau; 3D20E22P, rosa. Einfügungen vergrößern die Skala auf der y-Achse, um niedrigere Ecdysteroid-Werte anzuzeigen.

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Um zu untersuchen, ob 3D20E22P und 3D20E während der Paarung übertragen werden, haben wir die weibliche LRT zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Paarung seziert. Während bei Jungfrauen kein Ecdysteroid identifiziert wurde, beobachteten wir unmittelbar nach der Kopulation (0,5 Stunden nach der Paarung, hpm) eine große Menge an 3D20E22P im LRT, die im Laufe der Zeit abnahm, parallel zu einem signifikanten Anstieg der 3D20E-Spiegel (Abb. 1). Unter Verwendung von chemisch synthetisiertem 3D20E als Standard stellten wir fest, dass die Konzentrationen dieses Steroidhormons in verpaarten LRT mindestens 100-fach höher waren als die von 20E (erweiterte Datentabelle 1). 3D20E22P ist daher das wichtigste männliche Ecdysteroid, das während der Paarung auf das weibliche LRT übertragen wird, und seine dephosphorylierte Form 3D20E kommt kurz nach der Paarung in großer Menge vor. Dies deutet auf eine herausragende Rolle des letztgenannten Ecdysteroids in der weiblichen Biologie nach der Paarung hin.

Mithilfe einer maßgeschneiderten Bioinformatik-Pipeline nach der Generierung neuer RNA-Sequenzierungsdatensätze (RNA-seq) (Abb. 2a) suchten wir nach Genen, die für 20E-modifizierende Ecdysteroidkinasen (EcK), Ecdysonoxidasen (EO) und Ecdysteroidphosphatphosphatasen kodieren ( EPP), das in Fortpflanzungsgeweben exprimiert wird. Wir identifizierten ein EPP-Kandidatengen und zwei potenzielle EcK-Gene (EcK1 und EcK2), konnten jedoch kein gutes EO-Kandidatengen finden. Bemerkenswert ist, dass das einzelne EPP-Gen in A. gambiae-MAGs in hohen Konzentrationen (98,9. Perzentil) exprimiert wurde, jedoch nicht im weiblichen LRT (Abb. 2b), entgegen unseren Erwartungen, da in diesem weiblichen Gewebe eine Dephosphorylierung von 3D20E22P stattfindet. Wir gingen daher davon aus, dass männliches EPP während der Kopulation übertragen werden könnte. Tatsächlich haben wir dieses Enzym durch MS im Atrium von Weibchen nach der Paarung identifiziert, indem wir in vivo eine stabile Isotopenmarkierung verwendeten, um weibliche Proteine zu maskieren (Abb. 2c und Ergänzungstabelle 1). Das Vorhandensein von EPP in den MAGs und in verpaarten (aber nicht jungfräulichen) weiblichen LRT wurde auch mithilfe eines spezifischen Antikörpers bestätigt (Abb. 2d).

a, Die maßgeschneiderte bioinformatische Pipeline, die zur Suche nach Genen verwendet wird, die EcKs, EOs und EPPs im Fortpflanzungsgewebe jedes Geschlechts kodieren. Die Zahlen neben den Pfeilen geben die Anzahl der männlichen und weiblichen Kandidaten bei jedem Schritt an. Diese Analyse identifizierte ein EPP-Gen (EPP) und ein EcK-Gen (EcK1), die bei Männern exprimiert wurden, und ein EcK-Gen (EcK2), das bei beiden Geschlechtern exprimiert wurde, ergab jedoch kein EO-Kandidatengen. b: Wärmekarte zum Vergleich der Expression von Kandidatengenen in Geweben von jungfräulichem (V) und verpaartem (M) A. gambiae und Anopheles albimanus. Spca, Spermatheca; MAGs, männliche Nebendrüsen; Körper, der Rest des Körpers einschließlich Brustkorb, Flügel, Beine, Fettkörper und Eingeweide bei beiden Geschlechtern und Eierstöcke bei Frauen. EcK2 wurde sowohl in den MAGs als auch in den Vorhöfen von A. gambiae stark exprimiert, wohingegen EPP nur in den MAGs gefunden wurde. c, Proteomics-Analyse des männlichen Ejakuloms, das bei 3, 12 und 24 hpm in den weiblichen Vorhof übertragen wurde, und zeigt die 67 am häufigsten vorkommenden Proteine. Die Weibchen wurden mit Futter aufgezogen, das 15N enthielt, um alle Proteine zu markieren (und zu maskieren). Nicht markierte Männchen wurden mit markierten Weibchen gepaart, und die weiblichen LRTs wurden zur Proteomanalyse bei 3, 12 und 24 hpm präpariert (eine vollständige Liste der Ejakulomproteine finden Sie in der Ergänzungstabelle 1). In den MAGs jungfräulicher Männchen wurden durch Proteomanalyse dieser Gewebe EPP, Eck1 und EcK2 nachgewiesen. d, EPP durch Western Blot in den MAGs und gepaarten weiblichen LRTs nachgewiesen, jedoch nicht bei jungfräulichen Weibchen oder im Rest des Körpers von Männchen oder Weibchen. Die Membran wurde gleichzeitig mit Anti-Actin- (Beladungskontrolle) und Anti-EPP-Antikörpern sondiert. Alle Männer waren Jungfrauen. Daten zur Gelquelle finden Sie in der ergänzenden Abbildung 1. Der Western Blot wurde zweimal mit ähnlichen Ergebnissen durchgeführt.

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Die Ecdysteroidphosphat-Phosphatase-Aktivität von EPP wurde nach Inkubation mit 3D20E22P, das aus den MAGs isoliert wurde, durch HPLC-MS/MS validiert (Extended Data Abb. 2a). Als wir EPP durch RNA-vermittelte Interferenz (RNAi) zum Schweigen brachten, stellten wir außerdem einen starken Rückgang der Phosphataseaktivität in diesen männlichen Fortpflanzungsgeweben fest (Abb. 3a), und Weibchen, die mit EPP-zum Schweigen gebrachten Männchen gepaart wurden, zeigten einen deutlich geringeren Anteil an dephosphoryliertem 3D20E (Abb. 3b) trotz teilweiser Gen-Stummschaltung (Extended Data Abb. 2b, c). Im Gegensatz dazu konnten wir bei denselben Mücken keine signifikante Änderung des 20E22P/20E-Verhältnisses feststellen, was möglicherweise auf die Spezifität dieses Enzyms für 3D20E22P hindeutet (Abb. 3b).

a, Verminderte Phosphataseaktivität in MAGs, verursacht durch EPP-Stummschaltung unter Verwendung von doppelsträngiger EPP-RNA (dsEPP) oder doppelsträngiger GFP-RNA (dsGFP) als Kontrolle. In jeder Wiederholung wurde ein Pool von 20 MAGs verwendet (P = 0,0046, gepaarter t-Test, zweiseitig), angezeigt durch separate Punkte. b: Weibchen, die mit EPP-stummgeschalteten Männchen gepaart wurden, haben einen deutlich geringeren Anteil an dephosphoryliertem 3D20E bei 3 hpm (P = 0,0043, ungepaarter t-Test, zweiseitig), während die 20E-Werte nicht beeinflusst werden (P = 0,063, ungepaarter t-Test, zweiseitig). Die Daten werden als Mittelwert ± Standardabweichung dargestellt und stammen aus drei Pools mit jeweils 13, 16 und 19 Frauen. c: Weibchen, die mit EPP-stummgeschalteten Männchen gepaart wurden, weisen eine deutlich höhere Wiederpaarungsrate auf (P = 0,0002, exakter Fisher-Test, zweiseitig). Die Weibchen wurden zunächst zwangsgepaart, um ihren Paarungsstatus sicherzustellen; Zwei Tage später wurden sie weiteren Männchen ausgesetzt, die transgene Spermien trugen, um die Remating-Raten durch quantitativen PCR-Nachweis des Transgens zu bestimmen. d: Mit Blut gefütterte Weibchen, die mit EPP-stummgeschalteten Männchen gepaart wurden, weisen einen signifikanten Rückgang der Fruchtbarkeit (P < 0,0001; Mann-Whitney-Test, zweiseitig) und einen leichten Rückgang der Eizahlen (P = 0,088, Mann-Whitney-Test, zwei) auf -seitig), wohingegen die Eiablagerate nicht beeinflusst wird (P = 0,94, exakter Fisher-Test, zweiseitig). In allen Panels gibt n die Anzahl der biologisch unabhängigen Mückenproben an. NS, nicht signifikant. *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001, ****P < 0,001.

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Als nächstes untersuchten wir, ob die Ecdysteroid-Dephosphorylierung wichtig ist, um die Paarungsresistenz der Weibchen hervorzurufen. Bemerkenswerterweise kam es bei Weibchen, die sich mit Männchen mit EPP-Mangel paarten, wesentlich häufiger (44,9 %) zu erneuten Paarungen als bei Kontrollweibchen (10,4 %), wenn sie zusätzlichen (transgenen) Männchen ausgesetzt waren (Abb. 3c). Wir beobachteten auch einen signifikanten Rückgang der Fruchtbarkeit (Abb. 3d, links) und einen geringfügigen Rückgang der Anzahl der von diesen Weibchen gelegten Eier (Abb. 3d, Mitte), während der Prozentsatz der Weibchen, die Eier legten (eine weitere Reaktion, die bei Weibchen durch die Paarung ausgelöst wird), zunahm ) war nicht betroffen (Abb. 3d, rechts). Angesichts der beobachteten Spezifität von EPP für 3D20E22P deuten diese Ergebnisse darauf hin, dass die Aktivierung von 3D20E durch während der Paarung übertragenes EPP eine wichtige Rolle bei der Abschaltung der weiblichen Empfänglichkeit für weitere Kopulation spielen könnte, ein Verhalten, das zuvor der sexuellen Übertragung von 20E zugeschrieben wurde. Daher beeinflusst dieses männerspezifische Hormon auch stark die weibliche Fruchtbarkeit.

Als nächstes verglichen wir die Aktivität von 20E und 3D20E in Injektionsexperimenten bei geschlechtsreifen Jungfrauen unter Verwendung von chemisch synthetisiertem 3D20E (Abb. 4a – c) und kommerziell erhältlichem 20E. Wir beobachteten, dass 3D20E bei zwei Konzentrationen die Anfälligkeit des Weibchens für die Paarung deutlich wirksamer ausschaltete als 20E (Abb. 4d). Bemerkenswert ist, dass 24 Stunden nach Injektionen in der höchsten Konzentration die Hälfte des physiologischen Spiegels von 3D20E im LRT (1.066 pg nach Injektionen gegenüber 2.022 pg nach der Paarung) einen größeren Anteil refraktärer Weibchen hervorrief als das 20-fache des physiologischen Spiegels von 20E (361 pg). nach Injektionen im Vergleich zu 18 pg nach der Paarung; erweiterte Datentabelle 1). Dieses Ergebnis stimmt mit der Annahme überein, dass die sexuelle Übertragung von 20E keine Paarungsresistenz hervorruft, und weist außerdem darauf hin, dass 3D20E der Hauptfaktor für die Vaterschaft ist. 3D20E zeigte auch in Eiablagetests bei jungfräulichen Weibchen eine signifikant höhere Aktivität als 20E (Abb. 4e), was darauf hindeutet, dass die normalen Eiablageraten, die wir nach teilweiser EPP-Stummschaltung beobachteten, auf weibliche Faktoren zurückzuführen waren, die immer noch durch die Paarung bei Vorhandensein einer verbleibenden 3D20E-Aktivität ausgelöst wurden.

(a,b) 3D20E chemisch synthetisiert aus 20E (a) mit sehr hoher Umwandlung/Effizienz (Daten dargestellt als Mittelwert ± Standardabweichung, abgeleitet aus drei unabhängigen Synthesereaktionen) (b). c, Massenspektren (untere Hälfte) stimmten perfekt mit denen von Ecdysteroiden überein, die im verpaarten weiblichen LRT gefunden wurden (obere Hälfte). d, Die Injektion von 0,63 µg oder 0,21 µg 3D20E induzierte eine signifikant höhere Paarungsresistenz als 20E (0,63 µg, P = 0,02; 0,21 µg, P < 0,0001; Exakte Fisher-Tests, zweiseitig) und 10 % Ethanol-Kontrollen (0,63 µg, P < 0,0001; 0,21 µg, P < 0,0001; Exakte Tests nach Fisher, zweiseitig), wohingegen 20E nur bei der höheren Dosis (0,63 µg, P = 0,0002; 0,21 µg, P = 0,54; Exakte Tests nach Fisher) signifikant höher war als bei den Kontrollen , zweiseitig). e, 3D20E-Injektionen führten bei jungfräulichen Weibchen zu signifikant höheren Eiablageraten als Kontrollen mit 10 % Ethanol (0,21 µg, P < 0,0001; 0,13 µg, P = 0,0003; exakte Fisher-Tests, zweiseitig), wohingegen 20E im Vergleich zu den Kontrollen nur bei signifikant war die höhere Dosis (0,21 µg, P = 0,022; 0,13 µg, P = 0,0823; Exakte Tests nach Fisher, zweiseitig). 3D20E induzierte bei höheren Dosen deutlich höhere Eiablageraten als 20E (0,21 µg, P = 0,0019; 0,13 µg, P = 0,075; exakte Fisher-Tests, zweiseitig). In allen Panels gibt n die Anzahl der biologisch unabhängigen Mückenproben an. NS, nicht signifikant. *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001, ****P < 0,001. Die Daten wurden aus drei Replikaten gepoolt.

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In früheren Studien haben wir festgestellt, dass die sexuelle Übertragung von Steroidhormonen die Expression von MISO (paarungsinduzierter Stimulator der Oogenese11) induziert, einem weiblichen Fortpflanzungsgen, das A. gambiae-Weibchen vor den Fitnesskosten schützt, die andernfalls durch eine Infektion mit Plasmodium falciparum13, dem tödlichsten Virus, verursacht werden menschlicher Malariaparasit. Angesichts der Bedeutung von MISO für die Fortpflanzungsfähigkeit von Anopheles in Malaria-Endemiegebieten haben wir beschlossen, zu bestimmen, welches Hormon, 3D20E oder 20E, die Expression dieses Gens auslöst. Wir fanden heraus, dass 20E-Injektionen einige Kernhormonrezeptoren (HRs) wie HR3 und HR4 und kanonische nachgeschaltete Steroidziele wie das Vitellogenese-Gen Vg14,15,16 spezifisch oder stärker induzierten, MISO jedoch durch 3D20E (Extended Data) stärker induziert wurde Abb. 3). Die sexuelle Übertragung dieses männlichen Steroidhormons scheint daher Mechanismen auszulösen, die Frauen vor Kosten schützen, die andernfalls durch eine Parasiteninfektion entstehen würden. Darüber hinaus wirkte sich 3D20E unterschiedlich auf zwei Isoformen des E-Rezeptors EcR aus, indem es EcR-A induzierte und EcR-B unterdrückte, und löste stärker andere paarungsinduzierte Gene aus, darunter HPX15, das die weibliche Fruchtbarkeit beeinflusst17. Dies könnte die erhebliche Unfruchtbarkeit erklären, die bei Weibchen beobachtet wurde, die mit EPP-stummgeschalteten Männchen gepaart wurden (Erweiterte Daten, Abb. 3). Diese Daten deuten auf die Existenz nachgeschalteter Signalwege hin, die vorzugsweise durch die beiden Ecdysteroide aktiviert werden und möglicherweise geschlechtsspezifischen Funktionen zugrunde liegen.

Als nächstes testeten wir die Funktion der beiden EcK-Gene, die in unserer Bioinformatik-Pipeline identifiziert wurden. Die Stummschaltung von EcK1 oder EcK2 führte bei Männern zu einer erheblichen Mortalität (Extended Data Abb. 4a), was zeigt, dass die Phosphorylierung von Ecdysteroiden und damit die Deaktivierung12 für das Überleben wichtig sind. Da EcK2 in höheren Konzentrationen exprimiert wird als EcK1 und in MAGs durch Proteomik nachgewiesen wurde (Abb. 2b, c und Ergänzungstabelle 2), haben wir seine Ecdysteroidkinase-Aktivität durch Inkubation mit 20E validiert, was zu phosphoryliertem 20E22P führte (Extended Data Abb. 4b). Wenn stattdessen 3D20E als Substrat verwendet wurde, konnten wir das Phosphorylierungsprodukt 3D20E22P nicht nachweisen (Extended Data Abb. 4c), was darauf hindeutet, dass 20E anstelle von 3D20E möglicherweise ein bevorzugtes Ziel von EcK2 ist.

Laut unserer RNA-seq-Analyse wird EcK2 auch im LRT jungfräulicher Weibchen stark exprimiert, wo es nach der Paarung ausgeschaltet wird (Abb. 2b). Wir haben diese Daten bestätigt und festgestellt, dass die EcK2-Expression durch die Blutfütterung nicht beeinflusst wird (Erweiterte Daten, Abb. 5a). Als wir unsere ersten MS-Experimente erweiterten, stellten wir fest, dass der Peak von 20E22P dem von 20E sehr ähnlich ist (22–26 Stunden nach einer Blutmahlzeit; erweiterte Daten, Abb. 5b). Die Stummschaltung von EcK2 bei jungfräulichen Weibchen führte 26 Stunden nach einer Blutmahlzeit zu einem dreifachen Anstieg des relativen Verhältnisses von 20E zu 20E22P (Extended Data Abb. 2c und 5c), was bestätigt, dass EcK2 auch 20E bei Weibchen phosphoryliert. Bemerkenswerterweise behielten EcK2-depletierte Jungfrauen ihre volle sexuelle Empfänglichkeit bei (Extended Data Abb. 5d, e), was weiter zeigt, dass von Frauen produziertes 20E keine Paarungsresistenz induziert. Diese Weibchen zeigten jedoch im Vergleich zu den Kontrolltieren einen signifikanten Anstieg der Eiablageraten, wobei mehr als 30 % der Jungfrauen Eier ablegten (Extended Data Abb. 5f). Eine Eiablage fand nicht statt, wenn doppelsträngige Eck2-RNA-Injektionen (dsEcK2) nach der Blutfütterung durchgeführt wurden, als der durch die Blutaufnahme induzierte 20E-Peak bereits zurückgegangen war. Insgesamt stützen diese Ergebnisse ein Modell, bei dem 20E, das nach der Bluternährung produziert wird, die Eiablage auslösen kann, jedoch nur, wenn die Eiablageblockaden (EcK2 und möglicherweise andere Faktoren) durch die Paarung ausgeschaltet werden. Weder 20E- noch 3D20E-Injektionen unterdrückten die EcK2-Expression bei Jungfrauen (Extended Data Abb. 5g), was darauf hindeutet, dass andere Faktoren die Unterdrückung dieser Kinase vermitteln. Die 20E-Spiegel nach der Blutfütterung reichen jedoch nicht aus, um eine Paarungsresistenz hervorzurufen, die stattdessen effizient durch hohe Titer an sexuell übertragenem 3D20E ausgelöst wird.

Unsere Ergebnisse liefern wichtige Einblicke in die Mechanismen, die den Fortpflanzungserfolg von A. gambiae regulieren. Es entsteht ein Modell, bei dem Männchen sich entwickelt haben, um hohe Titer von 3D20E zu synthetisieren, einem männerspezifischen, modifizierten Ecdysteroid, das die Vaterschaft gewährleistet, indem es Weibchen gezielt für eine weitere Paarung desensibilisiert. Parallel dazu haben diese Malaria-Überträger auch ein effizientes System zur Aktivierung von 3D20E bei Frauen entwickelt, das auf der sexuellen Übertragung von männerspezifischem EPP basiert. Unseres Wissens ist dies das erste Beispiel eines Systems männlicher und weiblicher Steroidhormone, die bei Insekten unterschiedliche und wichtige Funktionen ausüben. Die Existenz männlich-spezifischer Ecdysteroid-Funktionen wurde postuliert, aber nicht endgültig nachgewiesen. Eine weitgehend widerlegte Hypothese18 besagt beispielsweise, dass solche Funktionen vom 20E-Vorläufer E1 ausgeführt werden könnten. Es ist gut belegt, dass Monandrie bei Drosophila stattdessen durch die sexuelle Übertragung kleiner Sexualpeptide ausgelöst wird19,20, die mit Neuronen interagieren, die den weiblichen Fortpflanzungstrakt über spezifische Sexualpeptidrezeptoren21,22 innervieren. Weitere Arbeiten sind erforderlich, um die nachgeschalteten Signalkaskaden zu identifizieren, die von 3D20E bei A. gambiae-Weibchen gesteuert werden, und um festzustellen, ob diese Kaskaden möglicherweise zwischen Mücken und Fruchtfliegen konserviert sind.

Angesichts der wichtigen Rolle von 3D20E für die Fruchtbarkeit und das Verhalten von Frauen, die in unserer Studie ermittelt wurde, bieten die Wege, die zur 3D20E-Synthese und -Aktivierung führen, neue Möglichkeiten für zukünftige Strategien zur Mückenbekämpfung, wie z. B. die Erzeugung konkurrenzfähiger steriler Männchen für Freilandfreisetzungen in Strategien zur Technik steriler Insekten23 oder die Nachahmung von 3D20E Funktion bei jungfräulichen Frauen. Eine männerspezifische Funktion für 3D20E könnte sich entwickelt haben, als A. gambiae und andere Cellia-Arten die Fähigkeit erlangten, ihre Samenflüssigkeit zu einem Paarungspfropfen zu koagulieren7, da dies die effektive Übertragung großer Mengen an Hormonen und hormonaktivierenden Enzymen ermöglichte. Im Gegenzug hat die Weiterentwicklung von 3D20E zur Durchsetzung der Monandrie auch Weibchen mit Mechanismen ausgestattet (durch die hohe Expression von MISO), die ihre Fortpflanzungsfähigkeit in Gebieten mit hoher Malaria-Endemizität begünstigen, was indirekt die Ausbreitung von Plasmodium-Parasiten fördert. Angesichts der Tatsache, dass weibliches 20E nachweislich das Überleben und Wachstum von P. falciparum bei Anopheles-Weibchen stark beeinflusst24, sind sowohl männliche als auch weibliche Steroidhormonwege heute Schlüsselaspekte bei der Interaktion zwischen Mücken und Parasiten.

Der Stamm A. gambiae G3 wurde unter Standard-Insektenbedingungen (26–28 °C, 65–80 % relative Luftfeuchtigkeit, 12:12 h Licht/Dunkel-Photoperiode) gezüchtet. Die Larven wurden mit Fischfutterpulver (TetraMin Tropical Flakes, Koi Pellets und Tetra Pond Sticks im Verhältnis 7:7:2) gefüttert. Erwachsene Mücken wurden nach Belieben mit 10 %iger Glucoselösung und wöchentlich mit menschlichem Blut (Research Blood Components) gefüttert. Jungfräuliche Mücken wurden durch Trennung der Geschlechter im Puppenstadium nach mikroskopischer Untersuchung der Terminalien gewonnen. Männer, die das DsRed-Transgen tragen, wurden bereits beschrieben25.

Zwangspaarungsexperimente wurden gemäß den zuvor beschriebenen Protokollen durchgeführt13. Zur natürlichen Paarung wurden vier Tage alte, jungfräuliche Weibchen zwei Nächte lang mit geschlechtsreifen, jungfräulichen Männchen im Verhältnis 1:3 gehalten. Bei Experimenten mit Männern, denen dsEPP injiziert worden war, fiel die gleichzeitige Käfighaltung mit den Tagen 3–4 nach der Injektion zusammen, als die Phosphataseaktivität maximal zum Schweigen gebracht wurde (Extended Data, Abb. 2b).

Mückengewebe, verbleibende Kadaver (Rest des Körpers) oder ganze Körper wurden in 100 % Methanol zerlegt und mit einem Perlenrührer (2-mm-Glasperlen, 2.400 U/min, 90 s) homogenisiert. Die Anzahl der Gewebe und das Methanolvolumen waren wie folgt: Rest des Körpers: 50 in 1.000 µl; MAGs, 50–100 in 80 µl; weibliche LRT, 25–50 in 80 µl. Die Methanolextraktion wurde ein zweites Mal mit dem gleichen Volumen Methanol am Pellet durchgeführt. Zelltrümmer wurden durch Zentrifugation entfernt. Methanol aus zwei Extraktionen wurde kombiniert und unter Stickstoffstrom getrocknet und in den folgenden Volumina 80 % Methanol in Wasser resuspendiert: Rest des Körpers, 50 µl; MAGs und weibliche LRT, 30 µl.

Die Proben wurden mit einem Massenspektrometer (ID-X, Thermo Fisher) analysiert, das an ein LC-Gerät (Vanquish, Thermo Fisher) gekoppelt war. Fünf Mikroliter Probe wurden auf eine 3 µm, 100 × 4,6 mm große Säule (Inspire C8, Dikma) injiziert, die bei 25 °C gehalten wurde. Die mobilen Phasen für die LC waren A (Wasser, 0,1 % Ameisensäure) und B (Acetonitril, 0,1 % Ameisensäure). Der LC-Gradient war wie folgt: 1 Minute bei 5 % B, gefolgt von einem Anstieg auf 100 % B in 11 Minuten. Nach 8 Minuten bei 100 % wurde die Säule 4 Minuten lang bei 5 % B erneut äquilibriert. Die Flussrate betrug 0,3 ml min−1. Die Ionisierung in der MS-Quelle erfolgte durch beheizte Elektrospray-Ionisierung im positiven und negativen Modus.

Das Massenspektrometer hat Daten im Voll-MS-Modus mit einer Auflösung von 60.000 über einen m/z-Bereich von 350 bis 680 gemessen. Die MS/MS-Daten wurden auf [M + H]+ (alle Ziele), [M − H2O + H] erfasst. + (alle Ziele) und [M − H]− (phosphorylierte Ziele). Die MS/MS-Daten wurden verwendet, um die Ecdysteroid-Natur der Ziele zu bestätigen, für die keine Standards verfügbar waren. Um ungezielte Ecdysteroide zu identifizieren, wurden die MS/MS-Daten für alle HPLC-Peaks mit einer relativen Häufigkeit von >15 % analysiert. Die Quantifizierung erfolgte mithilfe von Standardkurven, die entweder aus reinen Standards (20E, 3D20E) erstellt wurden, um absolute Mengen zu berechnen, oder anhand von Verdünnungen einer bestimmten Probe (alle anderen Ziele), um deren Äquivalenz mit der bei einem Mann gefundenen Menge zu berechnen. Für 3D20E wurde die Quantifizierung mit der Summe der folgenden Addukte durchgeführt: [M + TFA]−, [M + COOH]−, [M + Na]+, [M + Cl]−, [M + NO3]−. Die Daten wurden mit Tracefinder (Version 4.1) extrahiert und quantifiziert. MS/MS-Daten wurden mit Xcalibur (Version 4.4) analysiert. Die MS-Spektren von E, 20E und 3D20E wurden mit den jeweiligen Standards verglichen. 3D20E22P wurde durch Derivatisierung mit Girards Reagenz analysiert. 20E22P wurde anhand des m/z-Verhältnisses analysiert.

3D20E22P wurde aus MAGs gereinigt. Die Reinigung wurde im analytischen Maßstab unter den gleichen LC-Bedingungen wie für die HPLC-MS/MS-Analyse unter Verwendung eines Ultra-Performance-Flüssigkeitschromatographiegeräts (Acquity, Waters) in Verbindung mit einem Quadrupol-Massendetektor (QDa, Acquity, Waters) durchgeführt. Die Fraktionssammlung wurde ausgelöst, als das m/z, das 3D20E22P entspricht, zur gleichen Retentionszeit wie zuvor identifiziert erkannt wurde. Die Reinheit der extrahierten Verbindungen wurde dann wie oben beschrieben mittels HPLC-MS/MS überprüft.

Die Gesamt-RNA wurde mit TRI-Reagenz (Thermo Fisher) aus Pools von 10–12 Fortpflanzungsgeweben oder dem Rest des Körpers (ohne Kopf) gemäß den Anweisungen des Herstellers extrahiert. Die RNA wurde mit TURBO DNase (Thermo Fisher) behandelt. Die cDNA wurde unter Verwendung der Reverse Transkriptase des Moloney-Maus-Leukämievirus (M-MLV RT; Thermo Fisher) gemäß den Anweisungen des Herstellers synthetisiert. Für die quantitative PCR mit reverser Transkription (RT-qPCR; erweiterte Datentabelle 2) verwendete Primer wurden zuvor veröffentlicht24 oder wurden mit Primer-BLAST26 entworfen, wobei Produkte mit einer Größe von 70–150 bp und Primer, die Exon-Exon-Verbindungen oder Primerpaare überspannen, bevorzugt werden getrennte Exons. cDNA-Proben von drei bis vier biologischen Replikaten wurden für die RT-qPCR vierfach in Wasser verdünnt. Die Quantifizierung wurde in 15-µl-Duplikatreaktionen durchgeführt, die 1× PowerUp SYBR Green Master Mix (Thermo Fisher), Primer und 5 µl verdünnte cDNA enthielten. Die Reaktionen wurden auf einem QuantStudio 6 Pro Real-Time PCR System (Thermo Fisher) durchgeführt und die Daten wurden mit Design and Analysis (Version 2.4.3) gesammelt und analysiert. Relative Mengen wurden gegen das ribosomale Gen RpL19 (AGAP004422) normalisiert, dessen Expression sich bei Blutfütterung27 oder Paarung3 nicht wesentlich ändert, wie in dieser Studie bestätigt.

Die RNA-Qualität wurde mit einem Agilent Bioanalyzer 2100 Bioanalyzer (Agilent) überprüft. Illumina-Paired-End-Bibliotheken wurden am Broad Institute of MIT und Harvard erstellt und betrieben. Die Sequenzierungsablesungen wurden mithilfe von HISAT2 (Version 2.0.5) mit den Standardparametern auf das A. gambiae-Genom (PEST-Stamm, Version 4.12) abgeglichen. Lesevorgänge mit Zuordnungsqualitätswerten (MAPQ) <30 wurden mit Samtools (Version 1.3.1) entfernt. Die Anzahl der den Genen zugeordneten Lesevorgänge wurde mit htseq-count (Version 0.9.1) mit den Standardparametern gezählt. Die Berechnung der normalisierten Lesezahlen und die Analyse der differentiellen Genexpression wurden mit dem DESeq2-Paket (Version 1.28.1) in R (Version 4.0.3) durchgeführt.

Ecdysteroid-modifizierende Genkandidaten wurden identifiziert, indem zunächst das A. gambiae-Genom mit dem PSI-BLAST-Algorithmus (https://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/blast/executables/blast+/2.8.1/) unter Verwendung der Standardeinstellung durchsucht wurde Parameter mit den folgenden Abfrageproteinsequenzen: EcK von Bombyx mori (Zugang NP_001038956.1), Musca Domestica (Zugang XP_005182020.1, XP_005175332.1 und XP_011294434.1) und Microplitis demolitor (Zugang XP_008552646.1 und XP_008552645.1); EPP von B. mori (Zugang NP_001036900), Drosophila melanogaster (Zugang NP_651202), Apis mellifera (Zugang XP_394838) und Acyrthosiphon pisum (Zugang: XP_001947166); und EO von B. mori (Zugänge NP_001177919.1 und NP_001243996.1) und D. melanogaster (Zugänge NP_572986.1) (Schritt 1). Als nächstes wurden die Treffergene auf der Grundlage einer hohen mRNA-Expression (>100 Fragmente pro Kilobase Exon pro Million kartierter Lesevorgänge (FPKM) oder >85. Perzentil) in Fortpflanzungsgeweben (weibliche LRT oder MAGs) von A. gambiae gefiltert (Schritt 2). . Für eine verbesserte Spezifität haben wir Kandidatenenzyme selektiert, die auch im Fortpflanzungsgewebe von A. albimanus exprimiert werden, einer Anophelinart, die während der Paarung keine Ecdysteroide synthetisiert oder überträgt7; Kandidatengene wurden auf der Grundlage einer geringen Expression (<100 FPKM oder <85. Perzentil) in Fortpflanzungsgeweben von A. albimanus gefiltert (Schritt 3). Als abschließender Filter (Schritt 4) mussten die Kandidatengene mindestens eines der folgenden Kriterien erfüllen: (1) signifikante Hochregulierung nach der Paarung (P < 0,05) gemäß der Analyse unterschiedlich exprimierter Gene und (2) mangelnde Expression in nicht exprimierten Genen -Reproduktionsgewebe (<85. Perzentil oder <100 FPKM).

Wir haben eine zuvor beschriebene Methode28,29,30 modifiziert, um eine Isotopenmarkierung des gesamten Organismus zu erreichen. Kurz gesagt, Wildtyp Saccharomyces cerevisiae Typ II (YSC2, Sigma) wurde in Medium gezüchtet, das (Gew./Vol.) 2 % Glucose (G7528, Sigma), 1,7 % Hefestickstoffbasis ohne Aminosäuren und Ammoniumsulfat (BD Difco, DF0335) enthielt ) und 5 % 15N Ammoniumsulfat (NLM-713, >99 %, Cambridge Isotope Laboratories) als einzige Stickstoffquelle. Hefe wurde durch Zentrifugation gewonnen und bis zur Verpuppung ad libitum an Mückenlarven verfüttert. Um den Tod im vierten Larvenstadium zu verhindern, wurde Fischfutter in Pulverform zugesetzt (0,5 mg pro 300 Larven). In Paarungsexperimenten mit unmarkierten Männchen wurden dann nur Weibchen verwendet, um das während der Kopulation übertragene männliche Proteom zu analysieren.

15N-markierte jungfräuliche Weibchen im Alter von 4–6 Tagen wurden mit gleichaltrigen, nicht markierten jungfräulichen Männchen zwangsgepaart. Die erfolgreiche Paarung wurde durch den Nachweis eines Paarungssteckers unter einem Epifluoreszenzmikroskop verifiziert. Bei 3, 12 und 24 hpm wurden die Vorhöfe von 45–55 begatteten Weibchen in 50 µl Ammoniumbicarbonatpuffer (pH 7,8) präpariert und mit einem Stößel homogenisiert. Das Homogenat wurde zentrifugiert und der Überstand mit 50 µl 0,1 % RapiGest (186001860, Waters) in 50 mM Ammoniumbicarbonat kombiniert. Der Überstand und das Pellet jeder Probe wurden auf Trockeneis eingefroren und über Nacht an das MacCoss Lab an der University of Washington geschickt, wo die Probenvorbereitung für LC-MS/MS abgeschlossen wurde. Die Pellets wurden in 50 µl 0,1 % RapiGest in 50 mM Ammoniumbicarbonat resuspendiert und in einem Wasserbad beschallt. Die Proteinkonzentration wurde sowohl für Pellets als auch für Überstände mittels BCA-Assay gemessen, und die Proben wurden mit 5 mM Dithiothreiotol (DTT; Sigma) reduziert, mit 15 mM Iodacetamid (Sigma) alkyliert und 1 Stunde lang bei 37 °C (1:50) mit Trypsin verdaut Trypsin:Substrat-Verhältnis). RapiGest wurde durch Zugabe von 200 mM HCl gespalten, gefolgt von einer 45-minütigen Inkubation bei 37 °C und einer 10-minütigen Zentrifugation mit 14.000 U/min bei 4 °C, um Trümmer zu entfernen. Die Proben wurden durch Dual-Mode-Festphasenextraktion (Oasis MCX-Kartuschen, Waters) gereinigt und in 0,1 % Ameisensäure bei einer Endproteinkonzentration von 0,33 µg µl-1 resuspendiert. Unmarkierte MAG-Proteome wurden in ähnlicher Weise von jungfräulichen Männern analysiert. Für jede Probe wurden zwei analytische Replikate analysiert. Anschließend wurde 1 µg jedes Probenaufschlusses unter Verwendung einer 25-cm-Fused-Silica-75-μm-Säule und einer 4-cm-Fused-Silica-Kasil1-Frittenfalle (PQ), beladen mit Jupiter C12-Reverse-Phase-Harz (Phenomenex), mit einer 180-minütigen LC analysiert –MS/MS-Lauf auf einem Q-Exactive HF-Massenspektrometer (Thermo Fisher), gekoppelt mit einem nanoACQUITY UPLC-System (Waters). Die aus jedem Lauf generierten datenabhängigen Erfassungsdaten wurden mit Proteowizard (Version 3.0.20287) in das mzML-Format konvertiert und mit Comet31 (Version 3.2) anhand einer FASTA-Datenbank durchsucht, die Proteinsequenzen von A. gambiae (VectorBase-Version 54) und Anopheles coluzzi enthielt Mali-NIH (VectorBase-Version 54), S. cerevisiae (Uniprot, März 2021), Drei-Frame-Übersetzungen von A. gambiae RNA-seq und bekannten menschlichen Kontaminanten. Peptid-Spektrum-Match-FDRs wurden mit Percolator32 (Version 3.05) bei einem Schwellenwert von 0,01 bestimmt, und Peptide wurden unter Verwendung von Proteinsparsimony in Limelight33 (Version 2.2.0) zu Proteinidentifikationen zusammengesetzt. Die relative Proteinhäufigkeit wurde mithilfe eines normalisierten spektralen Häufigkeitsfaktors (NSAF) geschätzt, der für jedes Protein in jedem Lauf wie zuvor beschrieben berechnet wurde28. Der NSAF relativ zu jedem Protein wurde über Proben aus zwei verschiedenen biologischen Replikaten gemittelt. Die 15N-Markierung maskierte erfolgreich das weibliche Proteom, obwohl eine kleine Anzahl unmarkierter Proteine bei markierten Jungfrauen nachgewiesen werden konnte. Wir haben den Nachweis männlicher Proteine in reduzierten Mengen (1–5 Spektren) in weiblichen jungfräulichen Proben nur in technischen Läufen dokumentiert, in denen die jungfräulichen Proben aufgrund der HPLC-„Verschleppung“ nach männlichen/gepaarten Proben analysiert wurden. Proteine, die gelegentlich als „Kontaminanten“ von gekennzeichneten Jungfrauen gefunden wurden, sind in der Ergänzungstabelle 1 aufgeführt.

Zwei antigene Peptide, QTTDRVAPAPDQQQ (innerhalb der Isoform PA) und MESDGTTPSGDSEQ (innerhalb beider Isoformen PA und PB), aus der EPP-Proteinsequenz wurden auf der Grundlage von Vorhersagen zur Antigenität, Oberflächenexpositionswahrscheinlichkeit und Hydrophilie identifiziert, die im Rahmen des maßgeschneiderten Antikörperservices bereitgestellt wurden bei Genscript. Die beiden Peptide wurden gepoolt und dann mit dem Trägerprotein KLH konjugiert und Neuseeland-Kaninchen injiziert. Nach der vierten Injektion wurden die Kaninchen getötet und das Gesamt-IgG mittels Affinitätsreinigung isoliert. IgG vom EPP-spezifischsten Kaninchen wurde für das weitere Western-Blotting verwendet.

Für das Western Blot wurden MAGs (n = 10, wobei n die Anzahl biologisch unabhängiger Mückenproben angibt) und weibliche LRTs (n = 30) aus 4 Tage alten jungfräulichen Männchen und jungfräulichen oder zwangsverpaarten Weibchen (<10 Min.) seziert nach der Paarung) bzw. in Proteinextraktionspuffer (50 mM Tris, pH 8,0; 1 % NP-40; 0,25 % Natriumdesoxycholat; 150 mM NaCl; 1 mM EDTA; 1× Proteaseinhibitormischung (Roche)). Die Proben wurden unmittelbar nach der Dissektion mit einem Perlenrührer (2-mm-Glasperlen, 2.400 U/min, 90 s) homogenisiert. Die unlöslichen Trümmer wurden durch Zentrifugation bei 20.000 g und 4 °C entfernt. Das Protein wurde durch den Bradford-Assay (Bio-Rad) quantifiziert. Anschließend wurden 20 µg MAG-Protein, 40 µg LRT-Protein und 20 µg Restkörperprotein denaturiert und durch 10 % Bis-Tris-NuPAGE unter Verwendung von MOPS-Puffer getrennt. Das Protein wurde mit einem iBlot2-Transfersystem (Thermo Fisher) auf eine Polyvinylidendifluoridmembran übertragen. Die Membranen wurden zweimal in 1 × PBS-T (0,1 % Tween-20 in PBS) gewaschen und dann 1 Stunde lang bei 22 °C in Odyssey Blocking Buffer (Li-Cor) blockiert. Die Membranen wurden mit dem speziellen polyklonalen Kaninchen-Anti-EPP-Primärantikörper (1:700 in Blockierungspuffer) und dem monoklonalen Ratten-Anti-Actin-Primärantikörper MAC237 (Abcam; 1:4.000) unter Schütteln über Nacht bei 4 °C inkubiert. Die Membranen wurden mit PBS-T gewaschen und dann mit sekundären Antikörpern (Esel-Anti-Kaninchen 800CW und Ziegen-Anti-Ratte 680LT (Li-Cor), beide bei 1:20.000) in Blockierungspuffer mit 0,01 % SDS und 0,2 % Tween inkubiert -20 für 1 Stunde bei 22 °C. Die Membranen wurden mit PBS-T gewaschen und mit einem Odyssey CLx-Scanner abgebildet. Bilder wurden in Image Studio (Version 5.2) gesammelt und verarbeitet. Es wurde keine spezifische Bande nachgewiesen, die der EPP-RA-Isoform (82 kDa) entspricht.

Die kodierenden Regionen von EPP (als Isoform AGAP002463-RB, enthaltend die Histidinphosphatase-Domäne, NCBI Conserved Domain Search34) und EcK2 (AGAP002181) wurden in das pET-21a(+)-Plasmid (Novagen Millipore Sigma) kloniert; Primer sind in der erweiterten Datentabelle 2 aufgeführt. Acht GS4-Linker (im Tandem) wurden vor dem C-terminalen 6×His-Tag in das pET-21a(+)-EcK2-Konstrukt eingefügt. Rekombinante Proteine wurden mit zellfreien Proteinsynthesereaktionen von NEBExpress aus Escherichia coli (New England BioLabs) hergestellt. Die rekombinanten Proteine wurden mit NEBExpress Ni-Spin-Säulen (New England BioLabs) gereinigt. Das Dihydrofolatreduktase (DHFR)-Kontrollprotein wurde unter Verwendung der DNA-Matrize aus dem NEBExpress-Kit für die zellfreie E. coli-Proteinsynthese hergestellt. Die Proteine wurden bis zu 3 Monate lang in 50 % Glycerin in PBS bei –20 °C gelagert.

Die Phosphataseaktivität von EPP und Gewebeextrakten wurde unter Verwendung von 4-Nitrophenylphosphat (pNPP; Sigma-Aldrich) gemessen. Der Reaktionspuffer enthielt 25 mM Tris, 50 mM Essigsäure, 25 mM Bis-Tris, 150 mM NaCl, 0,1 mM EDTA und 1 mM DTT. Die Gewebe wurden in Reaktionspuffer homogenisiert und Zelltrümmer durch Zentrifugation entfernt. Die Reaktion wurde durch Zugabe von Enzym oder Gewebeextrakt zum Reaktionspuffer, der 2,5 mg ml−1 pNPP enthielt, initiiert. Die Reaktionsmischung wurde bei Raumtemperatur im Dunkeln inkubiert und die Menge an aus pNPP umgewandeltem pNP wurde durch Messung der Absorption bei 405 nm zu verschiedenen Zeitpunkten quantifiziert.

Für die In-vitro-EcK-Aktivität wurden Proteine mit 0,2 mg 20E oder 3D20E in 200 µl Puffer (pH 7,5), der 10 mM HEPES-NaOH, 0,1 % BSA, 2 mM ATP und 10 mM MgCl2 enthielt, 2 Stunden lang bei 27 °C inkubiert . Die Reaktion wurde durch Zugabe von 800 µl Methanol beendet und dann 1 Stunde lang bei –20 °C gekühlt, gefolgt von einer 10-minütigen Zentrifugation bei 20.000 g bei 4 °C. Der Überstand wurde dann mittels HPLC-MS/MS analysiert. Um die in den Kontrollgruppen verwendeten Proteine durch Hitze zu inaktivieren, wurden die Proteine 20 Minuten lang bei 95 °C in 50 % Glycerin in PBS inkubiert.

Für die In-vitro-EPP-Aktivität wurden Proteine mit 3D20E22P (entspricht der in 18 MAG-Paaren gefundenen Menge, gereinigt durch HPLC-MS/MS) in 100 µl Puffer (pH 7,5), der 25 mM Tris, 50 mM Essigsäure enthielt, inkubiert. 25 mM Bis-Tris, 150 mM NaCl, 0,1 mM EDTA und 1 mM DTT bei 27 °C für 3 Stunden. Die Reaktion wurde durch Zugabe von 400 µl Methanol beendet und 1 Stunde lang bei –20 °C gekühlt, gefolgt von einer 10-minütigen Zentrifugation bei 20.000 g bei 4 °C. Der Überstand wurde mittels HPLC-MS/MS analysiert.

PCR-Fragmente von EPP (362 bp), EcK1 (AGAP004574, 365 bp) und EcK2 (556 bp) wurden aus cDNA amplifiziert, die aus kopflosen Mückenkadavern gemischten Geschlechts hergestellt wurde. Ein PCR-Fragment der eGFP-Kontrolle (495 bp) wurde aus dem zuvor beschriebenen pCR2.1-eGFP amplifiziert11; Die PCR-Primer sind in der erweiterten Datentabelle 2 aufgeführt. PCR-Fragmente wurden zwischen den invertierten T7-Promotoren auf dem pL4440-Plasmid eingefügt. Plasmidkonstrukte wurden aus NEB 5-alpha-kompetentem E. coli (New England Biolabs) gewonnen und vor der Verwendung durch DNA-Sequenzierung verifiziert (siehe Ergänzungsdaten 1 für Insertsequenzen). Ein zum T7-Promotor passender Primer (erweiterte Datentabelle 2) wurde verwendet, um Inserts aus pL4440-basierten Plasmiden zu amplifizieren. Die PCR-Produktgrößen wurden durch Agarosegelelektrophorese bestätigt. dsRNA wurde aus den PCR-Vorlagen unter Verwendung des Megascript T7-Transkriptionskits (Thermo Fisher) transkribiert und gemäß den Anweisungen des Herstellers mit den zuvor beschriebenen Modifikationen gereinigt35.

Für die dsRNA-Injektion wurden 1.380 ng dsRNA (dsGFP, dsEcK1, dsEcK2, dsEPP) in einer Konzentration von 10 ng nl-1 in den Thorax erwachsener Männer oder Frauen innerhalb eines Tages nach der Eklosion injiziert (Nanoject III, Drummond). Die Gen-Knockdown-Werte wurden in mindestens drei biologischen Replikaten durch RNA-Extraktion, cDNA-Synthese und RT-qPCR bestimmt. Für Ecdysteroid-Injektionen wurden je nach Versuchsaufbau 4 Tage alten, jungfräulichen oder 6 Tage alten, jungfräulichen, mit Blut gefütterten Weibchen 0,13, 0,21 oder 0,63 µg 20E oder 3D20E in einer Konzentration von 0,13, 0,21 oder 0,63 µg injiziert (Nanoject III, Drummond). 1,3, 2,1 bzw. 6,3 ng nl−1. Zehn Prozent (Vol./Vol.) Ethanol in Wasser wurden in einem Volumen von 100 nl injiziert; 3D20E22P in 10 % Ethanol wurde in einem Volumen von 100 nl injiziert (entspricht 75 % der in einem MAG-Paar enthaltenen Menge). Die Mücken wurden nach dem Zufallsprinzip den Injektionsgruppen zugeordnet.

Für Eiablagetests wurden drei Tage alte Weibchen ad libitum mit menschlichem Blut gefüttert. Teilweise oder nicht gefütterte Mücken wurden entfernt. Abhängig von der Behandlung wurden die Weibchen mindestens 48 Stunden nach der Blutmahlzeit für vier Nächte in einzelne Eiablagebecher gegeben. Die Eier wurden unter einem Stereoskop (Stemi 508, Zeiss) gezählt; Bei begatteten Weibchen wurden Eier, aus denen Larven schlüpften, als fruchtbar gewertet.

Für Paarungstests wurde den Weibchen je nach Behandlung mindestens 2 Tage Zeit gegeben, um eine Paarungsresistenz zu entwickeln, und anschließend wurden altersentsprechende Wildtyp-Männchen in denselben Käfig gesetzt. Nach zwei Nächten wurden Spermatheken von Weibchen präpariert und die genomische DNA durch Einfrieren, Auftauen und Ultraschallbehandlung in einem Puffer mit 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA und 25 mM NaCl (pH 8,2) freigesetzt. Die Proben wurden mit Proteinase K (0,86 µg µl−1) 15 Minuten lang bei 55 °C und anschließend 10 Minuten lang bei 95 °C inkubiert. Das rohe genomische DNA-Präparat wurde 10-fach verdünnt und einem qPCR-Nachweis einer Y-Chromosomensequenz unterzogen; Die Primer sind in der erweiterten Datentabelle 2 aufgeführt. Das Fehlen einer Y-Chromosomensequenz weist darauf hin, dass keine Paarung stattgefunden hat.

Für Remating-Assays wurden zwangsgepaarte Weibchen auf das Vorhandensein von Paarungssteckern überprüft, um den Paarungsstatus zu bestätigen, und ihnen wurde zwei Tage Zeit gegeben, um in Abwesenheit von Männchen eine Paarungsresistenz zu entwickeln, wie zuvor beschrieben36. Anschließend wurden Männchen, die transgene DsRed-Spermien trugen, in weibliche Käfige eingeführt. Nach zwei Nächten wurden Spermatheken von Weibchen präpariert und die genomische DNA wie oben beschrieben hergestellt und einem qPCR-Nachweis des DsRed-Transgens unterzogen; Die Primer sind in der erweiterten Datentabelle 2 aufgeführt. Das Fehlen des DsRed-Transgens weist darauf hin, dass keine Rematierung stattgefunden hat.

3D20E wurde wie zuvor beschrieben synthetisiert37. Kurz gesagt, 10 mg 20E (Sigma-Aldrich) wurden in 10 ml Wasser gelöst und dann 30 mg Platinschwarz (Pulverform, Sigma-Aldrich) hinzugefügt. Ein sanfter O2-Gasstrom wurde kontinuierlich in die Reaktionsmischung eingeleitet, die bei Raumtemperatur gerührt wurde. Nach 6 h wurde die Reaktion durch Zugabe von 30 ml Methanol beendet. Die Mischung wurde zentrifugiert und das Katalysatorpellet entfernt. Der Überstand wurde im Vakuum bei Raumtemperatur zur Trockne eingedampft. Das getrocknete Reaktionsprodukt wurde in 10 % Ethanol zur Injektion und Methanol zur HPLC-MS/MS-Analyse gelöst. Die Umwandlungsrate (von 20E zu 3D20E) betrug etwa 97 % (Abb. 4b), und die MS-Spektren des synthetisierten 3D20E stimmten mit denen von 3D20E bei verpaarten Weibchen überein (Abb. 4c).

Die Legenden der Abbildungen enthalten spezifische Details zu den durchgeführten statistischen Tests. GraphPad (Version 9.0) wurde verwendet, um Fishers exakte Tests, Mantel-Cox-Tests und Student-t-Tests durchzuführen. Cochran-Mantel-Haenszel-Tests wurden mit einem angepassten R-Skript durchgeführt (verfügbar unter https://github.com/duopeng/mantelhaen.test). Die Normalität der Datenverteilung wurde mit dem Shapiro-Wilk-Test unter Verwendung einer Signifikanzschwelle von 0,05 getestet. Mann-Whitney-Tests wurden durchgeführt, wenn die Daten den Normalitätstest nicht bestanden. Die Überlebensdaten wurden mit dem Mantel-Cox-Test analysiert. Das DESeq2-Paket (Version 1.28.1) wurde verwendet, um eine differenzielle Expressionsanalyse auf RNA-seq-Genebene durchzuführen. Horizontale Balken in Diagrammen stellen Mediane dar. Als Schwellenwert wurde in allen Tests ein Signifikanzwert von P = 0,05 verwendet.

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der Nature Research Reporting Summary, die mit diesem Artikel verlinkt ist.

Alle Original-Western-Blots finden Sie in den Zusatzinformationen.

Die MS-Proteomdaten wurden über das PRIDE-Partner-Repository (https://www.ebi.ac.uk/pride/) mit der Datensatzkennung PXD032157 beim ProteomeXchange-Konsortium (http://proteomecentral.proteomexchange.org) hinterlegt.

Die RNA-seq-Datensätze wurden im Gene Expression Omnibus-Repository (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/) unter dem Seriendatensatz GSE198665 hinterlegt.

Weitere Datensätze, die während der aktuellen Studie erstellt und/oder analysiert wurden, sind auf begründete Anfrage beim entsprechenden Autor erhältlich. Quelldaten werden mit diesem Dokument bereitgestellt.

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Wir danken E. Nelson, K. Thornburg und E. Selland für ihre Hilfe bei der Mückenaufzucht und den Mitgliedern des Catteruccia-Labors für Kommentare zum Manuskript. Die Finanzierung dieser Studie erfolgte durch einen gemeinsamen Faculty Scholars Award des Howard Hughes Medical Institute und der Bill and Melinda Gates Foundation (BMGF) (Förderungs-ID OPP1158190) sowie durch die National Institutes of Health (NIH) (Auszeichnungsnummern R01 AI104956 und R01 AI124165). Die Arbeit von FC Proteomics wurde vom NIH (P41 GM103533) unterstützt, die Arbeit von MJM RNA-seq wurde von der Harvard Data Science Initiative (Postdoctoral Fellow Research Fund, 2019) von DP unterstützt. Die Ergebnisse und Schlussfolgerungen in dieser Veröffentlichung stammen von den Autoren und nicht von DP spiegeln zwangsläufig die Positionen oder Richtlinien des HHMI, des BMGF oder des NIH wider. FC ist ein HHMI-Ermittler.

Evdoxia G. Kakani & Sara N. Mitchell

Aktuelle Adresse: Verily Life Sciences, South San Francisco, CA, USA

Enzo Mameli

Derzeitige Adresse: Abteilung für Genetik, Blavatnik Institute, Harvard Medical School, Boston, MA, USA

Abteilung für Immunologie und Infektionskrankheiten, Harvard TH Chan School of Public Health, Boston, MA, USA

Duo Peng, Evdoxia G. Kakani, Enzo Mameli, Sara N. Mitchell, Kelsey Adams, Tasneem A. Rinvee, W. Robert Shaw und Flaminia Catteruccia

Harvard Center for Mass Spectrometry, Cambridge, MA, USA

Charles Vidoudez

Abteilung für Genomwissenschaften, University of Washington, Seattle, WA, USA

Gennifer E. Merrihew und Michael J. MacCoss

Howard Hughes Medical Institute, Chevy Chase, MD, USA

Flaminia Catteruccia

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DP, EGK, SNM, WRS und FC haben die Studie konzipiert, Experimente entworfen und Daten interpretiert. DP, EGK, SNM, KA und TAR führten Paarungstests durch. CV führte Ecdysteroid-Massenspektrometrieanalysen durch. EGK und SNM führten die Sammlung von RNA-seq-Proben und die Vorbereitung der Bibliothek durch. DP, EGK und SNM analysierten die RNA-seq-Daten. DP hat die maßgeschneiderte Bioinformatik-Pipeline aufgebaut. EM führte die Isotopenmarkierung des gesamten Organismus und die Entnahme von Proteomproben durch. GEM und MJM führten eine Proteom-Massenspektrometrieanalyse durch. DP führte Western Blots durch und koordinierte die Produktion des maßgeschneiderten Antikörpers. DP, EGK, SNM und TAR führten dsRNA-Silencing, Genexpressions-RT-qPCR-Analyse, Eiablagetests und Remating-Tests durch. DP und TAR führten Mortalitätstests durch. DP führte chemische Synthesen durch, exprimierte und reinigte rekombinante Proteine und führte enzymatische Tests durch. DP, WRS und FC haben den Artikel geschrieben. FC betreute die Studie.

Korrespondenz mit Flaminia Catteruccia.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Nature dankt Michael O'Connor und den anderen, anonymen Gutachtern für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit. Peer-Reviewer-Berichte sind verfügbar.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

3D20E und 3D20E22P werden bei (a) jungfräulichen, mit Blut gefütterten Weibchen und (b, links) frisch geschlüpften (innerhalb eines Tages nach dem Schlüpfen) Weibchen nicht nachgewiesen, werden jedoch spezifisch in (b, rechts) den akzessorischen Drüsen (MAGs) frisch geschlüpfter Weibchen nachgewiesen -geschlossene Männchen. E, 20E und 20E22P werden in den meisten Proben in unterschiedlichen Konzentrationen nachgewiesen. In allen Panels: Die Daten werden als Mittelwert ± Standardabweichung dargestellt, abgeleitet aus drei biologischen Replikaten (pbm = nach der Blutmahlzeit).

Quelldaten

(a) Schematische Darstellung der Reaktion, die voraussichtlich durch sexuell übertragenes EPP im Vorhof der begatteten Frau katalysiert wird. Die gepunktete Linie markiert die Phosphateinheit, auf die EPP abzielt. Rekombinantes EPP (rEPP) katalysiert die Dephosphorylierung von 3D20E22P in vitro. Unter Verwendung von 3D20E22P (extrahiert aus den MAGs durch HPLC-MS/MS) als Substrat wurde HPLC-MS/MS verwendet, um die 3D20E-Produktion nach Inkubation mit dem rekombinanten Enzym nachzuweisen. DHFR: Dihydrofolatreduktase, als Negativkontrolle verwendet; HI: Hitzeinaktiviertes rEPP, verwendet als zweite Negativkontrolle. Die Daten werden als Mittelwerte ± Standardabweichung dargestellt, die aus drei In-vitro-Assay-Replikaten abgeleitet wurden. (b) Zeitverlaufsanalyse der EPP-Expression (rot) und Phosphataseaktivität (lila) in den MAGs relativ zu dsGFP am Tag 0 (Mittelwert ± Standardabweichung). Die EPP-Werte waren zwei Tage nach der Injektion (dpi) am niedrigsten und die Phosphataseaktivität war bei 3–4 dpi am niedrigsten. Die Daten wurden aus drei Replikaten gepoolt. (c) RT-qPCR-Silencing-Effizienzen für dsRNA-Injektionen, normalisiert auf das ribosomale Housekeeping-Gen RpL19 und berechnet als Expression des Zielgens relativ zur GFP-Kontrolle (Mittelwert ± Standardabweichung). Die Daten wurden aus drei Replikaten gepoolt.

Quelldaten

3D20E-Injektionen (0,63 µg) induzieren eine deutlich stärkere Expression von MISO im Vergleich zur gleichen Menge an 20E. 3D20E-Injektionen aktivieren auch spezifisch oder stärker die Expression der EcR-Isoform A (EcR-A) und der paarungsinduzierten Gene AGAP006421, AGAP004263 und HPX15, während sie die EcR-Isoform EcR-B unterdrücken. 20E-Injektionen aktivieren spezifisch die Dotterprotein-Gene Vg und HR4 und induzieren stärker die HR3-Expression (die Daten werden als Mittelwerte ± Standardabweichung dargestellt, die aus drei biologischen Replikaten von Pools mit jeweils 10 Mücken abgeleitet wurden (die HR4-Daten stammen aus vier biologischen Replikaten von Pools von). 10 Mücken) wurden ungepaarte, zweiseitige, FDR-korrigierte t-Tests für 20E vs. 3D20E-Vergleiche durchgeführt; die statistische Signifikanz über jedem Balken zeigt den Vergleich mit 10 % EtOH-Injektion an: ungepaarter t-Test, zweiseitig). Siehe Ergänzungstabelle 3 für P-Werte

Quelldaten

(a) Das Überleben von Männern wird durch die Stummschaltung von EcK1 und EcK2, nicht jedoch von EPP, negativ beeinflusst. Die Überlebensrate ist bei EcK1-stummgeschalteten Männchen (links) und Eck2-stummgeschalteten Männchen (Mitte) deutlich niedriger, bei EPP-stummgeschalteten Männchen (rechts) jedoch nicht im Vergleich zu dsGFP-Kontrollen (Mittelwert ± Standardabweichung, n gibt die Anzahl der biologisch unabhängigen Mückenproben an). , Mantel-Cox-Test, zweiseitig). (b–c) Rekombinantes EcK2 (rEcK2) phosphoryliert effizient (b) 20E, jedoch nicht (c) 3D20E, wie durch HPLC-MS/MS bestimmt. Mittelwerte ± SEM wurden aus drei In-vitro-Assay-Replikaten abgeleitet. Negativkontrollen (DHFR und hitzeinaktiviert, HI, rEcK2) phosphorylieren 20E oder 3D20E nicht. Es werden schematische Darstellungen der durch EcK2 katalysierten Reaktionen bereitgestellt

Quelldaten

(a) Die Expression von EcK2 ist im unteren Fortpflanzungstrakt (LRT) jungfräulicher Weibchen hoch und wird nach der Paarung unterdrückt. Bluternährung hat keinen Einfluss auf die EcK2-Expression zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Blutmahlzeit (pbm) (0 h: P = 0,024, 3 h: P = 0,031, 24 h: P = 0,029, Mittelwert ± SEM, ungepaarter t-Test, ein- einseitig). (b) 20E22P wird im LRT jungfräulicher Weibchen nach einer Blutmahlzeit nachgewiesen (Mittelwert ± SEM). Die Quantifizierung erfolgte mittels HPLC-MS/MS. Gepunktete Linien verbinden Mittelwerte desselben Ecdysteroids zu verschiedenen Zeitpunkten. (c) Die Stummschaltung von EcK2 vor der Blutfütterung erhöht das Verhältnis von 20E zu 20E22P bei 26 pbm im LRT jungfräulicher Weibchen signifikant (P = 0,047, Mittelwert ± Sem, ungepaarter t-Test, einseitig). (d) Die Paarungsempfänglichkeit (bewertet durch das Vorhandensein eines Paarungspfropfens) bei bluternährten jungfräulichen Weibchen wird durch die EcK2-Stummschaltung nicht beeinträchtigt (P = 0,50, exakter Fisher-Test, zweiseitig, Daten aus zwei Replikaten gepoolt). (e) Die Paarungsempfänglichkeit wird bei Jungfrauen durch die EcK2-Stummschaltung nicht beeinträchtigt (P = 0,98, Cochran-Mantel-Haenszel-Test, zweiseitig). (f) Die Eiablage wird bei Jungfrauen stark induziert, wenn EcK2 vor der Blutfütterung ausgeschaltet wird (oben) (P = 3,30e-06, Cochran-Mantel-Haenszel-Test, zweiseitig, Daten stammen aus vier Wiederholungen), aber nicht, wenn dies der Fall ist Die Kinase wird nach der Blutzufuhr zum Schweigen gebracht (unten) (P = 0,94, Cochran-Mantel-Haenszel-Test, zweiseitig). (g) Die EcK2-Expression wird durch die Injektion von 20E oder 3D20E im Vergleich zu mit 10 % EtOH injizierten Kontrollen nicht unterdrückt. Die Expressionswerte wurden in den jeweiligen Proben auf das Housekeeping-Gen RpL19 normalisiert, bevor die Faltungsänderungen berechnet wurden (Mittelwerte ± Standardabweichung, ungepaarte t-Tests, zweiseitig, 20E: P = 0,46, 3D20E: P = 0,85). In allen Panels: n gibt die Anzahl der biologisch unabhängigen Mückenproben an, ns = nicht signifikant. * P < 0,05, ** P < 0,01, *** P < 0,001, **** P < 0,001. Die Daten stammen von drei biologischen Replikaten in allen Panels, sofern nicht anders angegeben

Quelldaten

Unbeschnittene Bilder, die bei der Erstellung von Abb. 2d verwendet wurden.

Liste der Proteine, die während der Kopulation (Ejakulom) vom Männchen in den weiblichen Vorhof übertragen werden. Einzelheiten finden Sie in Abb. 2c und Methoden. Die Proteinhäufigkeit wird als NSAF über zwei Replikate über drei Zeitpunkte hinweg angezeigt.

Liste der von MS in den MAGs nachgewiesenen Proteine. Die Proteinhäufigkeit wird als NSAF über drei Replikate hinweg angezeigt.

Sequenzen von dsRNA-Konstrukten (Zielgen-spezifische Sequenzen).

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Nachdrucke und Genehmigungen

Peng, D., Kakani, EG, Mameli, E. et al. Ein männliches Steroid kontrolliert das weibliche Sexualverhalten bei der Malariamücke. Natur 608, 93–97 (2022). https://doi.org/10.1038/s41586-022-04908-6

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Eingegangen: 24. Januar 2022

Angenommen: 25. Mai 2022

Veröffentlicht: 06. Juli 2022

Ausgabedatum: 04. August 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41586-022-04908-6

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Ein männliches Steroid kontrolliert das weibliche Sexualverhalten bei der Malariamücke