Östrogen stärkt die Integrität der Blutgefäße im Knochen während der Schwangerschaft und den Wechseljahren

Nature Cardiovaskuläre Forschung Band 1, Seiten 918–932 (2022)Diesen Artikel zitieren

4256 Zugriffe

36 Altmetrisch

Details zu den Metriken

Das Skelettsystem von Säugetieren weist geschlechtsspezifische Unterschiede in Struktur, Funktionen, Alterung und Krankheitshäufigkeit auf. Die Rolle von Blutgefäßen bei physiologischen, regenerativen und pathologischen Knochenfunktionen weist auf die Notwendigkeit hin, ihre Geschlechtsspezifität zu verstehen. In dieser Studie haben wir herausgefunden, dass Östrogen die Blutgefäßphysiologie während der Schwangerschaft und Menopause durch den Östrogenrezeptor Alpha (ERα) und den G-Protein-gekoppelten Östrogenrezeptor-1 (GPER1) reguliert, bei Mäusen jedoch nicht durch ERβ-abhängige Signale. Östrogen reguliert die Lipidverwendung von Knochenendothelzellen (BECs) und fördert die Lipolyse von Adipozyten und die Aufnahme von Fettsäuren (FA) aus der Mikroumgebung. Niedrige Östrogenzustände verzerren den endothelialen FA-Metabolismus und akkumulieren Lipidperoxide (LPOs), was zur Gefäßalterung führt. Hohe Eisenionenwerte in weiblichen BECs intensivieren die LPO-Anreicherung und beschleunigen den Alterungsprozess. Bemerkenswert ist, dass die Hemmung der LPO-Erzeugung mithilfe von Liproxstatin-1 bei älteren Mäusen die Knochengesundheit deutlich verbesserte. Somit zeigen unsere Ergebnisse die Auswirkungen von Östrogen auf BECs und legen nahe, dass LPO-Targeting eine effiziente Strategie zur Steuerung der Blut- und Knochengesundheit bei Frauen sein könnte.

Veränderungen im Skelettsystem während der Pubertät, Schwangerschaft und Menopause werden durch Sexualhormone gesteuert, die direkt oder indirekt den physiologischen und pathologischen Knochenumbau regulieren1,2. Die Rolle von Sexualhormonen auf mesenchymale Zellen und hämatopoetische Zellen ist gut bekannt3,4. Obwohl sie eine zentrale Rolle in der Skelettphysiologie spielen, indem sie Entwicklung, Reparatur, Alterung und Krankheit regulieren5,6,7, ist das Ausmaß, in dem sich die Blutgefäßfunktionen zwischen den Geschlechtern unterscheiden, noch immer kaum verstanden. In dieser Studie untersuchten wir Blutgefäßveränderungen während der Schwangerschaft und der Menopause sowie die Rolle von Steroidhormonen bei der Vermittlung von Wachstum und Alterung von BECs.

Um zelluläre Veränderungen in der mütterlichen Knochenmikroumgebung (BM) während der Schwangerschaft zu verstehen, haben wir die Tibia trächtiger Mäuse an verschiedenen Tagen nach dem Koitum (dpc) mithilfe verbesserter Bildgebungsmethoden analysiert8. Wir verwendeten Endomucin (Emcn) und CD31 zur Markierung von Blutgefäßen, Osterix zur Markierung von Zellen der frühen Osteoblastenlinie (OBL) und Perilipin zur Identifizierung von Adipozyten im BM. CD31high/Emcnhigh-exprimierende Typ-H-Kapillaren sind angiogene Blutgefäße, die die Osteogenese im Knochen unterstützen9,10. Wir beobachteten einen deutlichen Anstieg der Typ-H-Gefäße und OBL-Zellen sowie einen Rückgang der Adipozyten in den Knochen von 10,5-dpc-trächtigen Muttertieren im Vergleich zu Wurfgeschwister-Jungfrauen, Männchen und anderen trächtigen Stadien (Abb. 1a und erweiterte Daten Abb. 1a, b). Ein erhöhter Prozentsatz der gesamten CD31+CD45−Ter119− Endothelzellen (ECs), CD31high/Emcnhigh (Typ-H) ECs innerhalb der gesamten ECs und proliferierenden (Ki-67+) ECs bestätigte die Förderung der Angiogenese bei 10,5 dpc (Abb. 1b, Erweiterte Daten Abb. 1c und ergänzende Abb. 1).

a: Repräsentative konfokale Bilder von Gefäßveränderungen vom Typ H (Emcnhigh/CD31high) in mütterlichen Knochen zu verschiedenen Zeitpunkten der Mausschwangerschaft und nach der Entbindung. Schwangerschaftszeitpunkte werden in Tagen nach dem Koitum (dpc) und Tage nach der Entbindung als Tage nach der Geburt (dpp) dargestellt. Maßstabsbalken, 40 μm. b, Quantifizierung der in a beschriebenen Typ-H-Gefäße als Fläche von Typ-H-ECs, normiert auf die Fläche der Metaphyse (mp) (n = 5); Gesamt-ECs (CD31+CD45−Ter119−) und Typ-H-ECs (CD31high/Emcnhigh) werden durch Durchflusszytometrie charakterisiert (n = 5). Bei den Daten handelt es sich um Mittelwerte ± Standardabweichung für die Bildquantifizierung und Mittelwerte ± Standardabweichung für Durchflusszytometriedaten. einfaktorielle ANOVA mit Tukey-Test. c, Repräsentative konfokale Bilder von Vehikel- und VCD-Modellmäusen (n = 5) (20 Wochen alt), die reduzierte Typ-H-Gefäße im VCD-Modell darstellen. Maßstabsbalken, 40 μm. Die Diagramme zeigen die Fläche der Typ-H-ECs, normalisiert auf die Fläche des MP, und die Gesamt-ECs, die durch Durchflusszytometrie quantifiziert wurden. Bei den Daten handelt es sich um Mittelwerte ± Standardabweichung für die Bildquantifizierung und Mittelwerte ± Standardabweichung für Durchflusszytometriedaten. ungepaarter zweiseitiger t-Test. d, Repräsentative konfokale Bilder, die Veränderungen in Typ-H-Gefäßen bei männlichen und weiblichen Mäusen (P28) nach Hormonbehandlungen mit Quantifizierung für Typ-H-ECs und Flächenquantifizierung (n = 5) zeigen; Durchflusszytometrie (Vehikel n = 5 F, n = 7 M; E2 n = 8 F, n = 7 M; P4 n = 5 F, n = 5 M; DHT n = 5 F, n = 5 M). Bei den Daten handelt es sich um Mittelwerte ± Standardabweichung für die Bildquantifizierung und Mittelwerte ± Standardabweichung für Durchflusszytometriedaten. Zweifaktorielle ANOVA mit Tukey-Test. Maßstabsbalken, 40 μm. F, weiblich; M, männlich.

Quelldaten

Um zelluläre Veränderungen in BMs während der Menopause zu verstehen, haben wir ein Menopause-Mausmodell erstellt, indem wir 12 Wochen alten Weibchen Vinylcyclohexendiepoxid (VCD) injizierten. Die Injektion von VCD über 20 Tage und die Analyse nach 32 Tagen bestätigten die vollständige Erschöpfung der Eierstockfollikel (ergänzende Abbildung 2), was die Bedingungen der Menopause beim Menschen modellierte11,12. Knochen von Mäusen in den Wechseljahren zeigten verminderte Gesamt- und Typ-H-BECs (Abb. 1c) zusätzlich zu reduzierten OBL-Zellen und erhöhten Adipozyten (Extended Data Abb. 1d). Diese Ergebnisse zeigen, dass Schwangerschaft und Menopause signifikante Veränderungen in den endothelialen und mesenchymalen Kompartimenten innerhalb des BM auslösten.

Um den Beitrag von Sexualhormonen zu diesen zellulären Veränderungen zu verstehen, verabreichten wir die Sexualhormone Östradiol (E2; 17β-Östradiol, 2 µg pro Tag), Progesteron (P4; 1 µg pro Tag) und Dihydrotestosteron (DHT; 100 µg pro Tag). an junge männliche und weibliche Mäuse für 10 Tage und analysierte ihre BMs nach 2 Wochen. Die systemische Behandlung mit E2 führte zur Ansammlung von Typ-H-Kapillaren im Knochenmarkskompartiment. Wir beobachteten eine höhere Häufigkeit von Gesamt- und Typ-H-ECs in Knochen beider Geschlechter im Vergleich zu Knochen, denen P4 und DHT verabreicht wurden (Abb. 1d und erweiterte Daten, Abb. 1e). Der Anstieg der OBL-Zellen und der Rückgang der Adipozyten der mit E2 behandelten Knochen deuteten darauf hin, dass zelluläre Veränderungen den schwangerschaftsbedingten Veränderungen ähnelten. Obwohl OBL-Zellen bei der DHT-Behandlung einen geringfügigen Anstieg zeigten, blieben die Adipozyten sowohl bei P4- als auch bei DHT-Behandlungen unverändert (Erweiterte Daten, Abb. 2a). Zusätzlich zu Typ-H-Kapillaren förderte E2 arterioläre (CD31+Emcn−-Gefäße) und transkortikale Gefäße (TCVs) in E2-behandelten Knochen. Die Kapillarsubtypen blieben bei P4- und DHT-Behandlungen unverändert (Erweiterte Daten, Abb. 2b). Die Analyse der EC-Proliferation mittels 5-Ethinyl-2′-desoxyuridin (EdU)-Markierung und Ki-67-Immunfärbung zeigte einen erhöhten Einbau von EdU und eine erhöhte Häufigkeit von Ki-67+ ECs in E2-behandelten Knochen. Ebenso zeigten kultivierte primäre BECs in vitro nach E2-Behandlung (10 μM) eine erhöhte Proliferation (Extended Data Abb. 2c, d). Wir analysierten auch die Transkriptmengen angiogener Faktoren in gereinigten BECs, um die Angiogenese zu verstehen. Eine höhere Expression bekannter angiogener Regulatoren in E2-behandelten BECs im Vergleich zu Vehikelkontrollen unterstützte die Förderung der Angiogenese in Knochen durch erhöhte E2-Spiegel (Extended Data, Abb. 2e). Die Quantifizierung der E2-Spiegel in verschiedenen Stadien der Trächtigkeit (Extended Data Abb. 3a) bestätigte erhöhte endogene Östrogenspiegel bei 10,5-dpc-trächtigen Muttertieren, die dem Status der Angiogenese in ihren Knochen entsprechen. In ähnlicher Weise verringerte das Altern die zirkulierenden E2-Spiegel bei Mäusen (Extended Data, Abb. 3b). Um Blutgefäßveränderungen in Knochen unter systemisch niedrigen E2-Bedingungen zu untersuchen, verwendeten wir ovarektomierte (OVX) Mausmodelle. Die Ovarektomie ist eine etablierte Methode, um den zirkulierenden E2-Spiegel zu senken und den Knochenschwund zu fördern13. Bei 8 Wochen alten weiblichen Mäusen wurde eine Ovarektomie durchgeführt und nach 6 Wochen wurden die Knochen analysiert. OVX-Mäuse zeigten vaskuläre und mesenchymale Phänotypen, die der Depletion der Ovarialfollikel ähnelten. Die Wiederherstellung der Knochenphänotypen bei OVX-Mäusen nach E2-Verabreichung belegte die zentrale Rolle von Östrogen in diesem Phänotyp (Extended Data, Abb. 3c). Wir verwendeten auch den pharmakologischen Aromatasehemmer Letrozol, um die Östrogensynthese zu stoppen und so den E2-Spiegel im Blutkreislauf zu senken. Die Verabreichung von Letrozol (100 µg pro Tag) an Mäuse reduzierte angiogene Typ-H-Kapillaren und OBL-Zellen und erhöhte die Adipozyten in sich entwickelnden Knochen (Extended Data, Abb. 3d). Diese Erkenntnisse belegen die Rolle von Östrogen bei der Regulierung des Blutgefäßwachstums im Knochen.

Um durch Östrogen vermittelte endothelspezifische Veränderungen zu untersuchen, untersuchten wir die ER-Signalübertragung in BECs. Die Transkriptanalyse für ERs in frisch isolierten BECs zeigte die Expression von Esr1 (ERα), Esr2 (ERβ) und Gper1 (GPER1) bei beiden Geschlechtern (Extended Data Abb. 4a). Wir untersuchten die Funktionen von ERs beim Blutgefäßwachstum, indem wir auf einzelne Rezeptoren in BECs abzielten. Wir erzeugten induzierbare EC-spezifische Mäuse mit Funktionsverlust unter Verwendung von loxP-flankierten Esr1- (Esr1lox/lox)14-, Esr2- (Esr2lox/lox)15- oder Gper1(Gper1lox/lox)16-Allelen mit der Cdh5(PAC)-CreERT2-Mauslinie17. Wir analysierten postnatale (4 Wochen alte) männliche und weibliche Knochen, um Blutgefäßveränderungen zu verstehen. Gendeletionen wurden durch Quantifizierung der Rezeptortranskriptspiegel in gereinigten BECs von Kontrollmäusen und mutierten Mäusen bestätigt (Extended Data, Abb. 4b). Die Deletion eines Rezeptors zeigte einen minimalen Einfluss auf die Transkriptniveaus der anderen Rezeptoren in BECs (Extended Data, Abb. 4b). Der EC-spezifische Funktionsverlust von Esr1 und Gper1 führte zu einer Verringerung der Gesamt- und Typ-H-ECs, wohingegen Esr2-Mutanten bei beiden Geschlechtern keinen endothelialen Phänotyp aufwiesen (Abb. 2). Somit beeinträchtigte die Hemmung der ERs Esr1 und Gper1 das Blutgefäßwachstum in den Knochen. Wir beobachteten auch eine Verringerung der OBL-Zahlen und einen Anstieg der Adipozyten in Esr1- und Gper1-Mutanten (Extended Data Abb. 4c). Wir führten eine Mikrocomputertomographie (Mikro-CT)-Analyse der mutierten Esr1- und Gper1-Knochen durch, um die Veränderungen auf der Ebene des gesamten Organs zu verstehen. Mikro-CT-Daten bestätigten die Verringerung des Trabekelknochens und den Anstieg des Lipidgehalts beider Endothelmutanten (Erweiterte Daten, Abb. 5a, b). Weitere Analysen zeigten, dass die Dicke und Fläche des kortikalen Knochens bei diesen Endothelmutanten unverändert blieb. Ebenso wurden Osteoklasten auf Knochenoberflächen durch die Deletion von ERs auf ECs nicht verändert. Gefäßassoziierte Osteoklasten, ein Subtyp der Osteoklasten an der osteochondralen Schnittstelle, sind auf angiogene Blutgefäße angewiesen18. Die Reduktion gefäßassoziierter Osteoklasten18 in der Metaphyse unterstützte das fehlerhafte Blutgefäßwachstum in diesen Mutanten (Extended Data Abb. 5a,b). Diese Ergebnisse zeigten die funktionelle Rolle der ER-Signalübertragung in BECs und Veränderungen im BM.

Repräsentative konfokale Bilder von Gefäßveränderungen vom Typ H (Emcnhigh/CD31high) nach endothelspezifischer Deletion von ERs (Esr1, Esr2 und Gper1) bei P28 bei Mäusen. Die Diagramme zeigen Quantifizierungen der gesamten ECs (CD31+CD45−Ter119−) mittels Durchflusszytometrie für Esr1 (Kontrolle n = 11 F, n = 7 M; Mutante n = 9 F, n = 6 M), Esr2 (Kontrolle n = 4 F). , n = 4 M; Mutante n = 6 F, n = 5 M), Gper1 (Kontrolle n = 6 F, n = 8 M; Mutante n = 6 F, n = 7 M); Quantifizierung des Typ-H-Gefäßvolumens pro MP-Feld für Esr1 (Kontrolle n = 11 F, n = 7 M; Mutante n = 9 F, n = 6 M), Esr2 (Kontrolle n = 4 F, n = 4 M; Mutante n = 6 F, n = 5 M), Gper1 (Kontrolle n = 6 F, n = 8 M; Mutante n = 7 F, n = 10 M); und Quantifizierung der Typ-H-EC-Fläche normalisiert auf die MP-Fläche für Esr1 (Kontrolle n = 11 F, n = 7 M; Mutante n = 9 F, n = 6 M), Esr2 (Kontrolle n = 4 F, n = 4 M). ; Mutante n = 6 F, n = 5 M), Gper1 (Kontrolle n = 6 F, n = 6 M; Mutante n = 6 F, n = 9 M). Bei den Daten handelt es sich um Mittelwerte ± Standardabweichung für die Bildquantifizierung und Mittelwerte ± Standardabweichung für Durchflusszytometriedaten. Zweifaktorielle ANOVA mit Tukey-Test. Maßstabsbalken, 40 μm. F, weiblich; M, männlich; mp, Metaphyse.

Quelldaten

Östrogenvermittelte Veränderungen im BM und ähnliche endotheliale ER-Mutantenphänotypen sowohl bei weiblichen als auch bei männlichen Mäusen haben uns dazu veranlasst, Geschlechtsunterschiede bei BECs zu untersuchen. Wir führten eine RNA-Sequenzierungsanalyse (RNA-seq) für gereinigte BECs von 2, 12 und 65 Wochen alten weiblichen und männlichen Mäusen durch, um ihre Geschlechtsunterschiede zu verstehen. Eine Genexpressionsanalyse in verschiedenen Wachstums- und Alterungsstadien würde altersbedingte Veränderungen der endothelialen Geschlechtsunterschiede liefern. Die Hauptkomponentenanalyse (PCA) trennte männliche und weibliche ECs in zwei Cluster, was auf Unterschiede zwischen den Geschlechtern in allen Altersgruppen hinweist (Abb. 3a und ergänzender Datensatz 1). Die Geschlechtsunterschiede in den BEC-Transkriptomen nahmen mit zunehmendem Alter zu, wobei 48 differentiell exprimierte (DE) Gene bei 2 Wochen alten Mäusen im Vergleich zu 212 bzw. 926 bei 12 bzw. 65 Wochen alten Mäusen bei einem Signifikanzniveau von Padj < 0,01 ( Abb. 3b). Wir beobachteten eine auffallend geringe Überlappung der DE-Gene zwischen den Altersgruppen, wobei die höchste Überlappung von 72 Genen zwischen erwachsenen und älteren Mäusen festgestellt wurde (Abb. 3c und erweiterte Daten Abb. 6a). Um die Bedeutung der Genexpressionsdaten zu verstehen, führten wir eine allgemein anwendbare Gen-Set-Anreicherung (GAGE) zur Pathway-Analyse für DE-Gene aus 65-Wochen-Daten durch19. Insgesamt vier Gensätze zeigten signifikante Unterschiede mit einer auffälligen Anreicherung des Gensatzes für Stoffwechselwege (Abb. 3d). Die Analyse der DE-Gene (Padj <0,05) in diesem Gensatz für Stoffwechselwege ergab, dass insgesamt 142 Gene zwischen männlichen und weiblichen BECs verändert waren, wobei 43 Gene mit dem FA-Metabolismus assoziiert waren (erweiterte Daten, Abb. 6b und ergänzender Datensatz 1). Allerdings gibt es nur begrenzte Kenntnisse über den Metabolismus von BECs und ihre Rolle bei der Angiogenese.

a, PCA-Diagramme von RNA-seq-Daten, die eine Clusterbildung nach Geschlecht in BECs von 2, 12 und 65 Wochen alten Mäusen (n = 3) zeigen. b: Vulkandiagramme zeigen die Anzahl signifikanter FDR-korrigierter (Bonferroni) P-Werte (Padj < 0,01) DE-Gene im Vergleich zur log2-fachen Änderung zwischen weiblichen und männlichen Knochen-ECs von 2, 12 und 65 Wochen alten Mäusen. DE-Gene wurden durch Anpassen jedes Gens an ein verallgemeinertes lineares Modell und anschließendes Hypothesentests mithilfe des Wald-Tests erhalten. c, Venn-Diagramm, das die Überlappung der DE-Gene zwischen männlichen und weiblichen Knochen-ECs von 2, 12 und 65 Wochen alten Mäusen zeigt. d, GAGE ​​zur Pathway-Analyse für DE-Gene in RNA-seq-Daten, die biologische Prozesse zeigen, die sich zwischen älteren männlichen und weiblichen BECs unterscheiden. Gendatensätze von Stoffwechselwegen, Zellzyklus und DNA werden hochreguliert und Gene des primären Immundefizienzwegs werden herunterreguliert. Die Signifikanz der Anreicherung wurde mithilfe von t-Tests bei zwei Stichproben berechnet und die signifikanten KEGG-Terme wurden mit P < 0,05 ausgewählt. e, Diagramm, das die Quantifizierung von Ki-67+-kultivierten BECs im nährstofffreien Medium, ergänzt mit Glucose, Glutamin oder FAs, mit Vehikel zeigt (Kontrolle n = 9, Glucose n = 11, Glutamin n = 15, FAs n = 12) und E2-Behandlung (Kontrolle n = 11, Glukose n = 11, Glutamin n = 13, FAs n = 12). Die Daten sind Mittelwerte ± SD; Zweifaktorielle ANOVA mit Tukey-Test. f, Diagramm, das die Quantifizierung von Ki-67+-kultivierten BECs zeigt, die mit Vehikel oder E2 behandelt wurden, mit oder ohne Etomoxir-Behandlung (n = 5). Die Daten sind Mittelwerte ± SD; Zweifaktorielle ANOVA mit Tukey-Test. g, Repräsentative konfokale Bilder von Typ-H-Gefäßen (Emcnhigh/CD31high) in mit Vehikel und Etomoxir behandelten Mäusen; Quantifizierung von Typ-H-ECs, normalisiert auf die Fläche der Metaphyse (mp) (n = 5). Die Daten sind Mittelwerte ± SD; ungepaarter zweiseitiger t-Test. Gesamt-ECs (CD31+CD45−Ter119−), quantifiziert durch Durchflusszytometrie (n = 5). Die Daten sind Mittelwerte ± Standardabweichung; ungepaarter zweiseitiger t-Test. Maßstabsbalken, 50 μm. PC, Hauptkomponente.

Quelldaten

Um die Grundstoffwechselregulation von BECs zu verstehen, haben wir wichtige Stoffwechselwege getestet, von denen bekannt ist, dass sie die Angiogenese in anderen Systemen regulieren20,21,22. Wir haben nach Nährstoffzusätzen gesucht, die die kultivierten BECs in Abwesenheit von FAs (serumfrei), Glukose und Glutamin unterstützen könnten. Wir fanden heraus, dass die Ergänzung primärer BECs mit FAs, jedoch nicht mit Glukose oder Glutamin, die BECs in vitro aufrechterhielt (Abb. 3e). Das Ergebnis veranlasste uns, den FA-Metabolismus in BECs weiter zu untersuchen und zu hemmen. CPT1A, Carnitin-Palmitoyltransferase 1a, ist ein geschwindigkeitsbestimmendes Enzym der FA-Oxidation durch den Transport von FAs in die Mitochondrien. Die Behandlung mit dem CPT1A-Inhibitor Etomoxir reduzierte das Wachstum kultivierter BECs (Abb. 3f). In ähnlicher Weise reduzierte die 10-tägige Verabreichung von Etomoxir an Mäuse am 10. postnatalen Tag (P10) das Wachstum von Blutgefäßen in den Knochen (Abb. 3g). Um die knochenendothelspezifische Rolle des FA-Metabolismus zu untersuchen, haben wir CPT1A in ECs genetisch gezielt angesteuert, indem wir Cpt1a-floxierte Mäuse21 verwendet haben, die mit EC-spezifischem Cdh5(PAC)CreERT2 gezüchtet wurden. Der Verlust der CPT1A-Funktion in BECs zeigte eine verringerte Oxidation von radioaktiv markiertem 3H-Palmitat, was auf einen beeinträchtigten FA-Metabolismus hinweist (Abb. 4a). Die Analyse der Blutgefäße zeigte eine Verringerung der Gesamt- und Typ-H-ECs von Cpt1aiΔEC-Knochen im Vergleich zu ihren Wurfgeschwisterkontrollen, was auf ein fehlerhaftes Blutgefäßwachstum hinweist (Abb. 4a). Darüber hinaus zeigten Cpt1aiΔEC-mutierte Knochen reduzierte OBL-Zellen und erhöhte Adipozyten. Die Mikro-CT-Analyse mutierter Knochen bestätigte die Veränderungen im Knochen- und Lipidgehalt (Extended Data Abb. 6c), was auf die Bedeutung des endothelialen FA-Metabolismus für die Regulierung des BM schließen lässt.

a, Diagramm, das die Oxidation von 3H-markiertem Palmitat durch Kontroll- und Cpt1a-deletierte BECs zeigt. Die Grafik zeigt die Cpt1a-mRNA-Spiegel in gereinigten BECs aus Kontroll- und Cpt1a-iΔEC-Mutantenknochen. Repräsentative konfokale Bilder von Typ-H-Gefäßen (Emcnhigh/CD31high) in Kontroll- und endothelialen Cpt1a-Deletionsmutanten mit Quantifizierung des Typ-H-Blutgefäßvolumens (Kontrolle n = 6 F, n = 8 M; Mutante n = 6 F, n = 5 M) und Gesamt-ECs (CD31+CD45−Ter119−), charakterisiert durch Durchflusszytometrie (Kontrolle n = 6 F, n = 5 M; Mutante n = 10 F, n = 5 M). Bei den Daten handelt es sich um Mittelwerte ± Standardabweichung für die Bildquantifizierung (Typ-H-Volumen) und Mittelwerte ± Standardabweichung für 3H-Palmitat, Durchflusszytometrie und qPCR-Daten. Zweifaktorielle ANOVA mit durchgeführtem Tukey-Test, mit Ausnahme der 3H-Palmitat-Daten (ungepaarter zweiseitiger t-Test). Maßstabsbalken, 40 μm. b, Diagramme, die die Oxidation von Glucose (Vehikel n = 6, E2 n = 5), Glutamin (Vehikel n = 5, E2 n = 5) und Palmitat (Vehikel n = 6, E2 n = 6) in mit Vehikel behandelten und E2- behandelte BECs, gemessen durch Radioaktivität (Zerfälle pro Minute (dpm)). Die Daten sind Mittelwerte ± Standardabweichung; ungepaarter zweiseitiger t-Test. c, Diagramm, das die Palmitatoxidation durch mit Vehikel oder E2 behandelte BECs zeigt, mit oder ohne Etomoxir-Behandlung (n = 5). Die Daten sind Mittelwerte ± Standardabweichung; Zweifaktorielle ANOVA mit Tukey-Test. d, Repräsentative konfokale Bilder, die Typ-H-Gefäße (Emcnhigh/CD31high) in Kontrollmäusen und mutierten Cpt1aiΔEC-Mäusen zeigen, die mit E2 behandelt wurden. Maßstabsbalken, 50 μm. Quantifizierungen zeigen Typ-H-ECs, normalisiert auf die Fläche von mp (Kontrolle n = 5 F, n = 5 M; Mutant n = 5 F, n = 5 M) und Gesamt-ECs (CD31+CD45−Ter119−), quantifiziert durch Durchflusszytometrie (Kontrolle n = 5 F, n = 5 M; Mutante n = 5 F, n = 5 M). Bei den Daten handelt es sich um Mittelwerte ± Standardabweichung für die Bildquantifizierung und Mittelwerte ± Standardabweichung für Durchflusszytometriedaten. Zweifaktorielle ANOVA mit Tukey-Test. F, weiblich; M, männlich; mp, Metaphyse.

Quelldaten

Als nächstes untersuchten wir, wie Östrogen den Endothelstoffwechsel beeinflusste, indem wir primäre BECs mit E2 behandelten. E2 veränderte die FA-Abhängigkeit von BECs unter nährstoffarmen Bedingungen nicht (Abb. 3e). Darüber hinaus deutete eine erhöhte Oxidation von 3H-Palmitat im Vergleich zur unveränderten Oxidation von 14C-Glucose oder 14C-Glutamin darauf hin, dass die E2-Behandlung die Verwendung von FAs förderte (Abb. 4b). Insbesondere hemmte Etomoxir die E2-vermittelte Zellproliferation (Abb. 3f) und die FA-Oxidation (Abb. 4c). Um die In-vivo-Beziehung zu verstehen, verabreichten wir Cpt1aiΔEC-Mutantenmäusen E2, um die Angiogenese zu untersuchen. Die Verabreichung von E2 führte nicht zu einer Wiederherstellung der in Cpt1aiΔEC-mutierten Knochen gehemmten Angiogenese, was die Downstream-FA-Abhängigkeit des E2-vermittelten Blutgefäßwachstums unterstützt (Abb. 4d), wohingegen E2 die OBL-Zellen erhöhte und die Adipozyten im mesenchymalen Kompartiment reduzierte (Erweiterte Daten, Abb. 6d). . Zusammengenommen deuten die Daten darauf hin, dass Östrogen FAs benötigt, um die Angiogenese in den Knochen voranzutreiben.

Es wurde vermutet, dass Adipozyten im Knochenmark freie FAs als Energiequelle für hämatopoetische Zellen freisetzen23. Wir haben festgestellt, dass BECs das Fettsäurebindungsprotein 4 (FABP4) exprimieren, einen Membranlipidtransporter, der an der Aufnahme, dem Transport und dem Metabolismus von FA beteiligt ist (Abb. 5a). Mit E2 behandelte Knochen zeigten eine Hochregulierung der FABP4-Expression in ihren Blutgefäßen (Abb. 5b und Extended Data Abb. 7a), was uns dazu veranlasste, den Lipidtransport in BECs zu untersuchen. Um die FA-Aufnahme in BECs zu analysieren, haben wir dem Medium einen kurzen 30-minütigen Impuls BODIPY-konjugierter synthetischer FAs gegeben. Der Nachweis hoher BODIPY-Spiegel in E2-behandelten BECs im Vergleich zu Kontrollen deutete auf eine Förderung der FA-Aufnahme durch E2 hin (Abb. 5c und erweiterte Daten Abb. 7b). Wir haben auch die FA-Werte in BECs nach der E2-Behandlung mit LipidTOX überprüft. Der Nachweis von mehr BECs mit hohen intrazellulären Lipidspiegeln unterstützte die Lipidaufnahme bei E2-Behandlung (Extended Data Abb. 7c). Um die funktionelle Rolle von FABP4 bei der FA-Aufnahme zu verstehen, behandelten wir BECs mit dem pharmakologischen FABP4-Inhibitor BMS-309403 in Gegenwart und Abwesenheit von E2. Reduzierte BODIPY-Spiegel in mit BMS-309403 behandelten BECs (Abb. 5c) deuteten auf die Beteiligung von FABP4 an der E2-vermittelten FA-Aufnahme hin. Darüber hinaus untersuchten wir die Lipidaufnahme in Gegenwart des ER-Signalinhibitors G36, einem pharmakologischen Antagonisten von GPER1. Eine beeinträchtigte BODIPY-Aufnahme in mit G36 behandelten BECs bestätigte den Lipidtransport als nachgeschalteten Mechanismus der ER-Signalübertragung (Extended Data Abb. 7d). Darüber hinaus zeigte eine verringerte FABP4-Expression in Blutgefäßen von Esr1iΔEC- und Gper1iΔEC-Mutantenmäusen (Extended Data Abb. 7e) den Zusammenhang zwischen fehlerhafter FA-Aufnahme und verringerter Angiogenese.

a: Maximalintensitätsprojektion eines konfokalen Bildes, das eine Überlappung der FABP4-Expression (grün) in Knochen-ECs mit der Emcn-Expression (rot) zeigt. Maßstabsbalken, 50 μm. b, Diagramme zeigen die Quantifizierung der FABP4-Proteinspiegel, die in Knochengewebeschnitten von mit Vehikel und E2 behandelten Knochen (n = 5) beobachtet wurden, abgebildet mittels konfokaler Mikroskopie. Die Daten sind Mittelwerte ± SD; Zweifaktorielle ANOVA mit Tukey-Test. Die Transkriptmengen wurden aus isolierten Knochen-ECs von Mäusen, denen Vehikel verabreicht wurde, und E2-verabreichten Mäusen (n = 5) mithilfe von qPCR quantifiziert. Die Daten sind Mittelwerte ± Standardabweichung; Zweifaktorielle ANOVA mit Tukey-Test. c, Repräsentative konfokale Bilder der Lipidaufnahme von BODIPY-konjugierten synthetischen FAs in mit Vehikel behandelten und E2-behandelten BECs nach Behandlung mit dem FABP4-Inhibitor BMS-309403. Maßstabsbalken, 15 μm. Die Quantifizierung zeigt reduzierte Fluoreszenzeinheiten (FU, Intensität) von endothelialem BODIPY nach FABP4-Hemmung über mehrere ×63-Sichtfelder (Vehikel n = 37; Vehikel + BMS-309403 n = 36; E2 n = 41; E2 + BMS-309403 n =). 42). Die Daten sind Mittelwerte ± SD; Zweifaktorielle ANOVA mit Tukey-Test. d, Repräsentative konfokale Bilder von BM-Adipozyten (Perilipin+, grün) aus jungen und alten Knochen. Maßstabsbalken, 50 μm. Die Diagramme zeigen die durchschnittliche Anzahl der Perilipin+-Adipozyten (n = 17), die Größe (n = 15) und die Quantifizierung der Fluoreszenzintensität, was auf eine Abnahme des lipolytischen Enzyms ATGL bei gealterten Mäusen (n = 84 F, 52 M) im Vergleich zu jungen Mäusen (n = 50 F, 58 M) pro Zelle über mehrere x20-Sichtfelder. Die Daten sind Mittelwerte ± SD; Zweifaktorielle ANOVA mit Tukey-Test. e, Repräsentative konfokale Bilder von BM-Adipozyten (Perilipin+), wobei die Quantifizierung der Fluoreszenzintensität eine Abnahme des lipolytischen Enzyms HSL bei gealterten Mäusen (HSL n = 120 F, 168 M) im Vergleich zu P28-Mäusen (HSL n = 78 F, 88 M) anzeigt ) pro Zelle über mehrere ×20-Sichtfelder. Die Daten sind Mittelwerte ± SD; Zweifaktorielle ANOVA mit Tukey-Test. Maßstabsbalken, 50 μm. F, weiblich; M, männlich; Plin, Perilipin.

Quelldaten

Eine fehlerhafte FA-Aufnahme und Angiogenese in BECs von Esr1iΔEC- und Gper1iΔEC-mutierten Knochen waren mit der Akkumulation von Adipozyten in der Mikroumgebung verbunden. Der altersbedingte Rückgang der Angiogenese und Osteogenese6,7,9,24,25 ging mit einem gleichzeitigen Anstieg der Adipozyten ein26,27. Ein verringerter angiogener Status alternder Knochen ist mit einer Zunahme der Anzahl und Größe der Adipozyten im Knochenmark verbunden. Im Gegensatz dazu zeigten junge Knochen mit hoher Angiogenese kleinere und weniger Adipozyten, was auf eine umgekehrte Beziehung zwischen angiogenen ECs und Adipozyten hinweist (Abb. 5d, e). Kleinere Adipozyten in jungen Knochen zeigten im Vergleich zu größeren Adipozyten in gealterten Knochen eine hohe Expression der lipolytischen Enzyme Fetttriglyceridlipase (ATGL) und hormonsensitive Lipase (HSL). Daher wiesen begrenzte Adipozyten in jungen angiogenetischen Knochen hohe Mengen an lipolytischen Enzymen auf. Ebenso zeigten gealterte Knochen mit reduzierter Angiogenese geringe Mengen an lipolytischen Lipasen in ihren Adipozyten (Abb. 5d, e).

Es wurde bereits gezeigt, dass Adipozyten ERs exprimieren und auf zirkulierende Östrogenspiegel reagieren28,29. Die Variation der Adipozytenzahlen in Endothelmutanten (siehe Adipozytenphänotypen von Esr1iΔEC-, Gper1iΔEC- und Cpt1aiΔEC-Mäusen) veranlasste uns jedoch, die Expression lipolytischer Enzyme in diesen Mutanten zu untersuchen. In mutierten Cpt1aiΔEC- und Gper1iΔEC-Knochen vorhandene Adipozyten zeigten geringe Mengen lipolytischer Lipasen (Extended Data Abb. 8a). Die Daten zeigten die Beteiligung von BECs an der Regulierung der Lipolyse von Adipozyten im BM. Um mögliche von EC abgeleitete Signale zu identifizieren, die auf Adipozyten wirken, wurden isolierte BECs auf die Expression lipolytischer Faktoren analysiert. Gereinigte BECs von Mäusen, denen E2 verabreicht wurde, zeigten eine Hochregulierung von Tnfa und Il6, bei denen es sich um bekannte parakrine lipolytische Faktoren handelt. Eine beeinträchtigte ER-Signalübertragung in Esr1iΔEC- und Gper1iΔEC-mutierten BECs zeigte eine Herunterregulierung der endothelialen Tnfa- und Il6-Spiegel (Extended Data, Abb. 8b). Eine verringerte Expression dieser lipolytischen Faktoren unterstützte die Ansammlung von Adipozyten in diesen mutierten Knochen. Ebenso setzte die E2-Behandlung von in vitro kultivierten BECs im Vergleich zur Kontrollbehandlung höhere Mengen an TNF-α und IL-6 im Medium frei (Extended Data Abb. 8c), was deren angiokrine Freisetzung aus BECs bestätigt. Eine verringerte Angiogenese und damit ein verringerter Lipidverbrauch in BECs ist mit einer verringerten Lipolyse und Ansammlung von Adipozyten im BM verbunden. Diese Daten deuten auf eine metabolische Wechselwirkung zwischen Angiogenese und Lipolyse im BM hin.

Die Alterung des Skeletts ist mit Veränderungen der Blutgefäße verbunden, die zum Knochenschwund beitragen9,24,25. Der altersbedingte Rückgang des Östrogenspiegels30,31,32,33 führte bei Frauen zu schwerem Knochenschwund. Es hat sich gezeigt, dass die Verabreichung von Östrogen altersbedingten Knochenschwund verhindert34,35,36,37. Die Verabreichung von E2 bei alternden Mäusen förderte die Gesamt-ECs, Typ-H-Kapillaren und OBL-Zellen und verringerte die Adipozyten (Erweiterte Daten, Abb. 9a). Wir stellten auch einen Anstieg der Arteriolen und transkortikalen Gefäße in den Knochen von Mäusen fest, denen E2 verabreicht wurde (Extended Data, Abb. 9b). Der altersbedingte Anstieg der zellulären reaktiven Sauerstoffspezies (ROS)38 ist weithin bekannt. Bemerkenswerterweise reduzierte die Verabreichung von E2 bei alternden Mäusen die endothelialen ROS-Werte in Blutgefäßen signifikant (Abb. 6a). Weitere Analysen zeigten eine Akkumulation von LPOs in alternden BECs, wie anhand von 4-Hydroxynonenal39 (HNE)-Werten und BODIPY 665/676, einem LPO-Sensor, nachgewiesen wurde. Wir fanden reduzierte LPO-Spiegel in BECs von Mäusen, denen E2 verabreicht wurde (Abb. 6b, c und Extended Data Abb. 9c). Ebenso deutete ein Anstieg der endothelialen HNE von Knochen in der Menopause auf die hohe Lipidperoxidation bei Östrogenmangel hin (Extended Data, Abb. 9d).

a, Repräsentative Durchflusszytometriediagramme der ROS-Erzeugung in ECs von mit Vehikel behandelten Mäusen (n = 8 F, n = 8 M) und E2-behandelten Mäusen (n = 7 F, n = 7 M). Rote Spitzen in den Histogrammdiagrammen weisen auf ungefärbte Zellen hin. Quantifizierungen zeigen eine Verringerung der ROS bei E2-Behandlung. Die Daten sind Mittelwerte ± Standardabweichung; Zweifaktorielle ANOVA mit Tukey-Test. b, Quantifizierung der 4-HNE-Spiegel in ECs durch Immunfärbung bei jungen, mit Vehikel behandelten Mäusen (n = 5 F, n = 5 M) und E2-behandelten Mäusen (n = 5 F, n = 5 M) und alten, mit Vehikel behandelten Mäusen Mäuse (n = 5 F, n = 5 M) und E2-behandelte Mäuse (n = 5 F, n = 5 M), die eine Verringerung der 4-HNE-Spiegel nach E2-Behandlung zeigten. Die Daten sind Mittelwerte ± SD; Zweifaktorielle ANOVA mit Tukey-Test. c, Repräsentative Durchflusszytometriediagramme der LPO-Erzeugung in ECs von jungen, mit Vehikel behandelten Mäusen (n = 5 F, n = 5 M) und E2-behandelten Mäusen (n = 5 F, n = 5 M) sowie alten, mit Vehikel behandelten Mäusen (n = 6 F, n = 5 M) und E2-behandelte Mäuse (n = 5 F, n = 5 M). Rote Spitzen in den Histogrammdiagrammen weisen auf ungefärbte Zellen hin. Quantifizierungen zeigen eine Verringerung des LPO bei der E2-Behandlung. Die Daten sind Mittelwerte ± Standardabweichung; Zweifaktorielle ANOVA mit Tukey-Test. d, Diagramm, das Geschlechtsunterschiede in den intrazellulären Eisenionenkonzentrationen in BECs von mit Vehikel behandelten und E2-behandelten Mäusen zeigt (n = 4). Die Daten sind Mittelwerte ± Standardabweichung; Zweifaktorielle ANOVA mit Tukey-Test. e, Repräsentative Durchflusszytometriediagramme mit Quantifizierungen, die Geschlechtsunterschiede bei intrazellulären Eisenionen in BECs bei P10-Mäusen (n = 6 F, n = 8 M) und gealterten Mäusen (n = 6 F, n = 4 M) zeigen. Die Daten sind Mittelwerte ± Standardabweichung; ungepaarter zweiseitiger t-Test. f, Repräsentative Durchflusszytometriediagramme mit Quantifizierungen, die einen Anstieg der Typ-H-ECs (CD31high/Emcnhigh) mit Lip-1-Behandlung bei gealterten Mäusen zeigen (Vehikel n = 6 F, n = 5 M; Lip-1 n = 5 F, n = 5 M). Die Daten sind Mittelwerte ± Standardabweichung; Zweifaktorielle ANOVA mit Tukey-Test. g: Repräsentative Durchflusszytometriediagramme von BEC-Populationen von mit Vehikel behandelten und mit Lip-1 behandelten Mäusen im Alter. Die Quantifizierungen beziehen sich auf ECs mit Lipid-ROS (Vehikel n = 6 F, n = 4 M; Lip-1 n = 4 F, n = 4 M), was auf eine Verringerung bei Lip-1-Behandlung hinweist. Rote Spitzen in den Histogrammdiagrammen weisen auf ungefärbte Zellen hin. Die Daten sind Mittelwerte ± Standardabweichung; Zweifaktorielle ANOVA mit Tukey-Test. F, weiblich; M, männlich.

Quelldaten

Es wurde gezeigt, dass FABP4 zum Schutz vor oxidativem Stress beiträgt, indem es den zellulären ROS40 reduziert. Bemerkenswerterweise verbesserte die Verabreichung von E2 die FABP4-Expression im gealterten Knochenendothel und deutete auf einen möglichen Zusammenhang zwischen FABP4 und LPOs in BECs hin (Extended Data Abb. 10a). Die Hemmung von FABP4 in BECs zeigte eine Akkumulation von HNE, was auf dessen Beteiligung an der LPO-Erzeugung schließen lässt (Extended Data Abb. 10b). Eine E2-Supplementierung konnte die FABP4-vermittelte HNE-Akkumulation nicht reduzieren, was auf eine FABP4-Abhängigkeit der E2-Funktion hinweist (Erweiterte Daten, Abb. 10b). Darüber hinaus sprachen die Daten dafür, die Funktion von E2 bei der Regulierung mehrerer zellulärer Mechanismen zu untersuchen, die zur Bildung von Peroxiden führen.

Zelluläre Fe2+-Spiegel tragen über einen Ferroptose-abhängigen Mechanismus zur Bildung von LPOs in Zellen bei41,42. Um den Beitrag von Fe2+ zum altersbedingten Anstieg der endothelialen LPO-Spiegel zu verstehen, untersuchten wir die Fe2+-Konzentration sowohl in männlichen als auch in weiblichen BECs. Die intrazelluläre labile Fe2+-Konzentration war bei gereinigten männlichen BECs höher als bei weiblichen und blieb durch die E2-Behandlung bei jungen BECs unverändert (Abb. 6d). Anschließend verwendeten wir die FeRhoNox-1-Markierung, um den Fe2+-Gehalt in BECs zu erkennen und zu quantifizieren. Bei der FeRhoNox-1-Markierung wurden bei jungen männlichen BECs im Vergleich zu weiblichen auch hohe Fe2+-Werte festgestellt. Interessanterweise zeigte die Quantifizierung in gealterten Knochen einen höheren Prozentsatz an Fe2+-BECs bei alternden Frauen im Vergleich zu Männern (Abb. 6e). Die Kultivierung primärer BECs mit Deferoxaminmesylat (DFM), einem Eisenchelatbildner, führte zu einer Verringerung der endothelialen LPO-Spiegel. Dementsprechend erhöhte die Induktion der Fe2+-vermittelten Peroxidproduktion mithilfe von Artemisinin die endothelialen LPO-Spiegel. Die E2-Behandlung reduzierte die LPO-Spiegel sowohl in DFM-behandelten als auch in Artemisinin-behandelten BECs in vitro (Erweiterte Daten, Abb. 10c). Es wurde gezeigt, dass DFM Typ-H-Gefäße und die Osteogenese bei älteren Mäusen fördert9. Wir fanden reduzierte LPO-Spiegel in BECs von Mäusen, denen DFM verabreicht wurde (Extended Data, Abb. 10d). Ebenso führte die Behandlung mit Artemisinin (200 mg kg−1) bei jungen Mäusen zu einer Verringerung der Typ-H-Kapillaren und OBL-Zellen, ohne dass sich die Adipozyten veränderten (Extended Data Abb. 10e). Diese Daten deuten auf die Rolle von Fe2+ bei der endothelialen LPO-Produktion und damit auf den Alterungsphänotyp der Blutgefäße im Knochen hin.

Hohe basale Fe2+-Spiegel bei älteren weiblichen ECs könnten die LPO-Produktion und den Verlust von Typ-H und Knochen bei Östrogenmangelzuständen wie der Menopause verschlimmern. Die Verringerung der LPO-Produktion durch E2 (Abb. 6b, c) deutete auf einen möglichen Mechanismus hin, der den klinischen Vorteilen der Hormonersatztherapie (HRT) bei postmenopausalem Knochenschwund zugrunde liegt. Um dies zu testen, haben wir die LPO-Produktion mit Liproxstatin-1 (Lip-1), einem Lipidperoxid-Inhibitor, bei alten Mäusen pharmakologisch gezielt. Ältere Mäuse, die mit der Vehikelkontrolle behandelt wurden, enthielten im Vergleich zu Mäusen, denen Lip-1 (10 mg kg-1) verabreicht wurde, nur wenige Typ-H-Gefäße, was einen Anstieg der angiogenen Kapillaren zeigte (Abb. 6f). Die Analyse der ROS-Spiegel in BECs zeigte eine Verringerung der mit Lip-1 behandelten Knochen (Abb. 6g). Darüber hinaus ist der Lip-1-vermittelte Anstieg der Typ-H-Kapillaren mit einem Anstieg der OBL-Zellen und einer Verringerung der Adipozyten in gealterten Knochen verbunden (Abb. 7a). Die Mikro-CT-Analyse gealterter Knochen bestätigte den beobachteten Anstieg des Knochengehalts und die Verringerung des Lipidgehalts bei mit Lip-1 behandelten Mäusen (Abb. 7b und erweiterte Daten Abb. 10f).

a, Repräsentative konfokale Bilder von BM bei gealterten Mäusen, die mit Lip-1 behandelt wurden, mit Diagrammen, die die Quantifizierung des Typ-H-Gefäßvolumens pro MP-Feld zeigen (Vehikel n = 5 F, n = 5 M; Lip-1 n = 5 F, n = 5 M), Osterix+-Zellen pro mm MP (Vehikel n = 5 F, n = 5 M; Lip-1 n = 5 F, n = 5 M) und Perilipin+-Fläche pro mm Fläche (Vehikel n = 5 F, n = 5 M; Lip-1 n = 5 F, n = 5 M). Die Daten sind Mittelwerte ± SD; Zweifaktorielle ANOVA mit Tukey-Test. Maßstabsbalken, 40 μm (Fahrzeug) und 50 μm (Lip-1). b: Repräsentative Mikro-CT-Bilder von Knochen gealterter Mäuse, die mit Lip-1 behandelt wurden, mit Diagrammen, die die Quantifizierung des trabekulären Knochenvolumens, der Anzahl, der Dicke und der Trennung (n = 4) und des Adipozytenvolumens (n ​​= 4) zeigen. Die Daten sind Mittelwerte ± Standardabweichung; Zweifaktorielle ANOVA mit Tukey-Test. F, weiblich; M, männlich; Osx, Osterix; Plin, Perilipin.

Quelldaten

In dieser Studie haben wir herausgefunden, dass Östrogen eine wichtige Rolle bei der Vermittlung des Blutgefäßwachstums spielt, indem es den FA-Metabolismus in BECs fördert (Abb. 8). Genetische ER-Funktionsverluststudien deuten auf eine konstituierende Östrogensignalisierung im Knochengefäßsystem sowohl männlicher als auch weiblicher BECs hin und sprechen stark dafür, deren Dosisabhängigkeit, Wechselwirkungen und Redundanz bei der Vermittlung nachgeschalteter Signalübertragung zu untersuchen.

Östrogen reguliert das Wachstum von Blutgefäßen im Knochen durch endotheliales ESR1 und GPER1. Die ER-Signalisierung reguliert die Nutzung des FA-Metabolismus durch ECs, indem sie die angiokrine Freisetzung von lipolytischen Faktoren, Enzymen und die FA-Aufnahme aus der Mikroumgebung fördert. Ein gestörter Lipidstoffwechsel im gealterten Endothel und geschlechtsspezifische Unterschiede im endothelialen Eisenionenspiegel stimulieren den Alterungsphänotyp in den Blutgefäßen der Knochen.

Die Angiogenese in aktiv wachsenden Knochen ist mit einer begrenzten Adipozytenzahl verbunden, und der altersbedingte Rückgang der Angiogenese ist mit der Ansammlung von Adipozyten im Knochen verbunden. Es wurde festgestellt, dass eine Östrogenbehandlung bei Frauen eine Lipolyse auslöst und den Lipidgehalt des Knochenmarks verringert43. Die Rolle von Östrogen bei der Regulierung von Knochenadipozyten ist weithin anerkannt. Hier zeigen wir einen bisher unbekannten Zusammenhang zwischen Blutgefäßen und Adipozyten. Wir fanden heraus, dass die Hemmung des Lipidstoffwechsels in BECs zu einem Anstieg der Adipozyten im BM führte. In Tiermodellen in den Wechseljahren ist eine Verringerung der Angiogenese mit der Ansammlung von Adipozyten verbunden, ähnlich wie beim Altern beim Menschen. Unsere Daten legen nahe, dass Östrogen die metabolische Kopplung regulieren könnte, um das Energiegleichgewicht im BM aufrechtzuerhalten, indem es die Lipolyse für das Wachstum von Blutgefäßen antreibt.

Die gewebespezifische Natur der Gefäßalterung44 befindet sich noch im Anfangsstadium des Verständnisses. Wir fanden heraus, dass intrinsische Eisenionenspiegel die Alterung von BECs beschleunigen und zum Knochenschwund beitragen können, der bei alternden Frauen im Vergleich zu Männern beobachtet wird. Die eisenabhängige Nicht-Häm-Natur von Lipoxygenasen bestätigt die Bedeutung von Eisen für den endothelialen LPO-Spiegel. Insgesamt ist Östrogen ein Schlüsselfaktor, der die LPO-Anreicherung in BECs begrenzt. Die kombinierte Wirkung von reduziertem Östrogen, Eisenionen und LPOs trägt zur beschleunigten Alterung bei Frauen bei. Diese Studie unterstützt die grundlegende Idee, Geschlechtsunterschiede im Gefäßsystem zu untersuchen, um die bei der Häufigkeit altersbedingter Herz-Kreislauf-Erkrankungen beobachtete geschlechtsspezifische Verzerrung zu verstehen. Die Ergebnisse dieser Studie identifizieren LPOs als nachgelagertes Ziel von Östrogen und legen nahe, dass die gezielte Behandlung von LPOs eine alternative Strategie zur HRT zur Behandlung von postmenopausalem Knochenschwund und Knochenreparatur sein könnte. Darüber hinaus kann das grundlegende Wissen über die Geschlechtsunterschiede im Knochenendothel bei der Entwicklung einer Präzisionsmedizin gegen Blut- und Knochenerkrankungen von Nutzen sein.

Alle Tierversuche wurden in Übereinstimmung mit den institutionellen Richtlinien und Gesetzen und gemäß den vom Imperial College London Animal Welfare and Ethical Review Body und dem Home Office UK genehmigten Protokollen durchgeführt. Alle Wildtyp-Experimente wurden an C57BL/6J-Mäusen durchgeführt und waren alters- und geschlechtsangepasst. Alle transgenen Mäuse wurden für jedes Experiment alters- und geschlechtsangepasst.

Bei den Schwangerschaftsexperimenten wurde der Beginn der Schwangerschaft durch das Vorhandensein eines Vaginalstopfens bestimmt. Mäuse wurden an relevanten Tagen nach der Identifizierung des Vaginalpfropfens getötet, zusammen mit jungfräulichen weiblichen und männlichen Mäusen als Kontrollen.

Zur Hormonbehandlung wurden Mäusen subkutan (sc) 2 μg 17β-Östradiol (Acros Organics), 1 mg Progesteron (Acros Organics) oder 100 μg DHT (TCI), gelöst in Ethanol und Maisöl (100 μl), injiziert. Vehikelmäuse erhielten die äquivalente Dosis Ethanol in Maisöl. Welpen (P10) erhielten zehn intermittierende Injektionen und ältere Mäuse (65–75 Wochen) erhielten sechs Wochen lang drei Injektionen pro Woche. Mäusen, denen 17β-Östradiol injiziert worden war, wurde 3 Stunden vor der Keulung intraperitoneal (ip) EdU (250 mg ml-1) injiziert, um ECs zu identifizieren, die einer Proliferation unterliegen. Welpen (P10) erhielten zehn Dosen von 10 μg Letrozol (Sigma-Aldrich) in DMSO zur Anti-Aromatase-Behandlung.

Für das Maus-Menopause-Modell wurden weiblichen Mäusen 20 Tage lang 160 mg kg-1 Tag-1 4-Vinylcyclohexendiepoxid (Fluorochem) injiziert und weitere 32 Tage stehen gelassen, um eine vollständige Follikelatresie zu induzieren. Täglich wurden Vaginalproben entnommen, um anhaltenden Dioöstrus zu bestätigen. Kontrollmäusen wurde PBS injiziert.

OVX-Mäuse wurden von Charles River Laboratories UK gekauft. Bei C57BL/6J-Wildtyp-Mäusen wurde eine Ovarektomie durchgeführt. E2-Kohorten erhielten 17β-Östradiol 2 Wochen nach der Operation für 4 Wochen (drei Injektionen pro Woche), während Kontrollkohorten Vehikelinjektionen erhielten.

DFM wurde den Mäusen 2 Wochen lang jeden zweiten Tag ip mit 25 μg g-1 Gewicht verabreicht. Die Mäuse wurden am Tag nach der letzten Injektion zur Analyse getötet. Um CPT1A zu hemmen, wurde Etomoxir in einer Menge von 30 mg kg-1 10 Tage lang ip injiziert und die Mäuse wurden auf P28 getötet.

Für die endothelspezifische Deletion von ERs wurden bedingte Esr1lox/lox-, Esr2lox/lox- oder Gper1lox/lox-Mäuse mit transgenen Cdh5(PAC)-CreERT2-Mäusen gezüchtet. Die Cre-Aktivität wurde durch Tamoxifen-Injektionen (80 mg kg−1) bei P10–P14-Mäusen induziert, und die Mäuse wurden bei P28 analysiert. Wurfgeschwister-Cre-Mäusen wurde ebenfalls Tamoxifen injiziert und sie dienten als Kontrollen. In ähnlicher Weise wurden bedingte Cpt1alox/lox-Mäuse mit transgenen Cdh5(PAC)-CreERT2-Mäusen zur endothelspezifischen Deletion gezüchtet, und die Mäuse wurden bei P28 analysiert. Um die Cre-Aktivität im Erwachsenenstadium zu induzieren, wurden Mäuse von P66 bis P70 injiziert und auf P84 getötet.

Um die Bildung von LPOs bei jungen Mäusen zu induzieren, wurden Jungtieren (P10) fünf intermittierende ip-Injektionen von Artemisinin (TCI, 200 mg kg−1) in DMSO verabreicht. Ältere Mäuse erhielten 4 Wochen lang 15 Dosen Lip-1 (Tocris Bioscience, 10 mg kg−1) ip, um die LPO-Produktion zu hemmen.

Die Tibiae wurden präpariert und gereinigt und einer sofortigen 4-stündigen Fixierung auf Eis in 4 %iger Paraformaldehydlösung (PFA) unterzogen, gefolgt von einer Entkalkung mit 0,5 M EDTA unter konstantem Rühren bei 4 °C. Anschließend wurden die Knochen weitere 48 Stunden lang in einer Kryokonservierungslösung (20 % (Gew./Vol.) Saccharose und 2 % (Gew./Vol.) Polyvinylpyrrolidin (PVP)) aufbewahrt. Für den Kryoschnitt wurden die Knochen in 8 % (Gew./Vol.) Gelatine, 20 % (Gew./Vol.) Saccharose und 2 % (Gew./Vol.) PVP eingebettet. Ein Leica-Kryostat wurde verwendet, um 70-μm-Schnitte auf Objektträgern zu erzeugen, die für die Immunfärbung verwendet wurden.

Für phänotypische Analysen von Tibiae mittels Immunhistochemie wurden Knochenschnitte mit PBS hydratisiert, gefolgt von einer Permeabilisierung mit 0,25 % Triton X-100 für 10 Minuten und einer Blockierung mit 5 % Eselserum (DS) für 30 Minuten. Der Primärantikörper wurde in 5 % DS verdünnt und 2,5 Stunden bei Raumtemperatur oder über Nacht bei 4 °C inkubiert. Zu den verwendeten Primärantikörpern gehörten Anti-Endomucin (Santa Cruz Biotechnology, 1:100), Anti-Osterix (Abcam, 1:600), Anti-CD31 (R&D Systems, 1:100) und Anti-Perilipin (Cell Signaling Technology, 1: 100), Anti-Perilipin (GeneTex, 1:100), Anti-Ki-67 (Abcam, 1:100), Anti-Laminin (Sigma-Aldrich, 1:100), Anti-FABP4 (R&D Systems, 1:100). ), Anti-4-hydroxynonenal (Abcam, 1:200), Anti-HSL (Cell Signaling Technology, 1:50), Anti-ATGL (Cell Signaling Technology, 1:100), Anti-CD45 (BD Pharmingen, 1: 100) und Anti-Itgb3 (Cell Signaling Technology, 1:100).

Die Objektträger wurden dann dreimal jeweils 5 Minuten lang mit PBS gewaschen und mit Fluorophor-konjugiertem Sekundärantikörper, verdünnt in 5 % DS, 1 Stunde lang bei Raumtemperatur inkubiert. Zu den verwendeten Sekundärantikörpern gehörten Anti-Ratten-Alexa Fluor 594 (Invitrogen, A21209, 1:400), Anti-Ratten-Alexa Fluor 488 (Invitrogen, A21208, 1:400) und Anti-Ziegen-Alexa Fluor 488 (Invitrogen, A11055, 1:400). ), Anti-Ziege Alexa Fluor 546 (Invitrogen, A11056, 1:400), Anti-Ziege Alexa Fluor 647 (Invitrogen, A21447; 1:400), Anti-Kaninchen Alexa Fluor 488 (Invitrogen, A21206, 1:400), Anti-Kaninchen-Alexa Fluor 546 (Invitrogen, A10040, 1:400) und DAPI für die Kernfärbung. Die Objektträger wurden dreimal jeweils 10 Minuten lang mit PBS gewaschen und dann mit einem Deckglas unter Verwendung einer Fluoromount G-Lösung (Southern Biotech) versehen.

Die EdU-Markierung wurde durch Click-iT-Chemie (Invitrogen, C10340) gemäß den Richtlinien des Herstellers nach Inkubation des primären und sekundären Antikörpers durchgeführt.

Hochauflösende dreidimensionale (3D) Bilder wurden mit einem konfokalen Laser-Scanning-Mikroskop Leica TCS SP8 und der Leica LASX-Software aufgenommen.

Wir haben frische Tibiae und Femur von Mutanten und ihren Wurfgeschwister-Kontrollen oder von Kontroll- und behandelten Mäusen für die Phänotypanalyse mittels Mikro-CT gesammelt. Frisch isolierte Knochen wurden gründlich gereinigt und in 4 % PFA fixiert. Zur Analyse mineralisierter Regionen in Knochen wurden fixierte Knochen für Mikro-CT-Scans verwendet. Für die Lipidanalyse führten wir eine Osmiumtetroxid-Markierung durch. Kurz gesagt, fixierte Knochen wurden 3–10 Tage lang in EDTA-Lösung entkalkt und 48 Stunden lang mit 2 % Osmiumtetroxidlösung gefärbt. Anschließend wurden die Knochen gründlich gewaschen und bis zur Analyse aufbewahrt. Die Knochen wurden mit dem Cabinet-Cone-Beam-Mikro-CT (μCT 100, Scanco Medical) und der IPL-Software Version 5.15 bei Scanco Medical gescannt. In allen drei Raumdimensionen wurde eine Voxelgröße von 10 μm gewählt. Für jede Probe wurden mindestens 400 Schichten ausgewertet, die mehr als 4 mm bei einer Spannung von 70 kVp, einer Intensität von 114 μA, 8 W und einer Integrationszeit von 800 ms abdeckten. Für die Auswertung wurde als interessierendes Volumen eine Länge von 3 mm unterhalb der Wachstumsfuge gewählt.

Schienbeine und Oberschenkelknochen wurden präpariert und in eiskaltem PBS gesammelt und anschließend unter sterilen Bedingungen mit sterilem PBS gewaschen. Die Knochen wurden mit Mörser und Pistill zerkleinert und die verbleibenden Knochentrümmer 20 Minuten lang bei 37 °C mit Kollagenase verdaut und zusammen filtriert, um eine Einzelzellsuspension zu erhalten. Zur Eliminierung der Erythrozyten wurde eine Lyse der roten Blutkörperchen (RBC) (ChemCruz) durchgeführt (5 Minuten, Raumtemperatur). Anschließend wurden die gesamten Zellen pelletiert und auf Eis aufbewahrt.

BECs wurden unter Verwendung von Dynabeads Schaf-Anti-Ratten-IgG (Invitrogen) gemäß dem Protokoll des Herstellers isoliert. Kurz gesagt, die Perlen wurden zunächst 45 Minuten lang auf einem Rotator bei 4 °C mit Ratten-Endomucin (Santa Cruz Biotechnology) beschichtet, mit Isolationspuffer (0,1 % FBS-PBS) auf einem Magnetgestell gewaschen und dann 30 Minuten lang mit allen Zellen inkubiert auf einem Rotator bei 4 °C, um nur ECs zu isolieren. Die Mischung wurde mit Isolationspuffer auf einem Magnetgestell gewaschen, um eine positive Auswahl an Endomucin-exprimierenden Zellen zu isolieren, und in mit EGM-2-Wachstum ergänzten EBM-2-Basalmedium (Lonza) in Fibronektin-beschichteten (Sigma-Aldrich) Zellkulturplatten ausplattiert Medium (2 % FBS, 0,4 % hFGF-B, 0,1 % VEGF, 0,1 % R3-IGF-1, 0,1 % Ascorbinsäure, 0,1 % hEGF, 0,1 % Heparin und 0,04 % Hydrocortison). Die Zellen wurden alle 3–4 Tage mit 0,25 % Trypsin-EDTA (Sigma-Aldrich) passagiert.

Für dieses Experiment wurden BECs verwendet, die einen Tag lang in EGM2-Komplettmedium gezüchtet wurden. Nach dem Waschen mit HBSS wurden die Zellen 16 Stunden lang entweder mit Vehikel (DMSO) oder mit 17β-Östradiol (10 μM) in glukosefreiem, glutaminfreiem und serumfreiem EC-Medium (Cell Biologics) behandelt und mit 5 mM Glucose ergänzt , 2 mM Glutamin oder 20 mM Linolsäure-Ölsäure (Sigma-Aldrich), um die Wirkung einer Nährstoffergänzung auf das Zellwachstum zu bestimmen. Die Zellen wurden mit Anti-Ki-67-Antikörper (Abcam, 1:300) zur Messung der EC-Proliferation oder mit Anti-gespaltenem Caspase-3-Antikörper (Cell Signaling Technology, 1:300) zur Messung der Apoptose gefärbt.

Auf Deckgläsern kultivierte BECs wurden 60 Stunden lang mit Vehikel (DMSO) oder 17β-Östradiol behandelt und dann entweder mit BODIPY 558/568 C12 (Thermo Fisher Scientific, 1 μM) inkubiert oder mit HCS LipidTOX Green (Thermo Fisher Scientific, 1:1.000) gefärbt ) für 30 Minuten bei 37 °C. Die Zellen wurden gewaschen und auf Objektträger montiert und mit einem konfokalen Leica TCS SP8-Mikroskop abgebildet.

Auf Deckgläsern kultivierte BECs wurden mit Vehikel (DMSO) oder 17β-Östradiol zusammen mit Etomoxir (100 μM) behandelt. Die Zellen wurden mit Anti-Ki-67-Antikörper (Abcam, 1:300) zur Messung der EC-Proliferation oder mit Anti-gespaltenem Caspase-3-Antikörper (Cell Signaling Technology, 1:300) zur Messung der Apoptose gefärbt.

Auf Deckgläsern kultivierte BECs wurden mit Vehikel (DMSO) oder 17β-Östradiol zusammen mit BMS-309403 (10 μM) behandelt. Die Zellen wurden mit BODIPY 558/568 C12 gefärbt, um festzustellen, ob die Lipidaufnahme verringert war.

Auf Deckgläsern kultivierte BECs wurden 60 Stunden lang mit Vehikel (DMSO) oder 17β-Östradiol zusammen mit G36 (Tocris Bioscience, 10 μM) behandelt und dann wie für die Lipidaufnahme erläutert auf BODIPY 558/568 C12 gefärbt.

BECs wurden getrennt aus männlichen und weiblichen Knochen kultiviert und vor dem Test 60 Stunden lang mit Vehikel (DMSO) oder 17β-Östradiol behandelt. BECs wurden durch Trypsinisierung und Zentrifugation gesammelt und durch Ultraschallbehandlung lysiert und in Eisentestpuffer (Abcam, ab8366) resuspendiert. Der Test wurde gemäß den Herstellerrichtlinien für den Eisen(II)-Test durchgeführt, wobei die optische Dichte (OD) bei 593 nm und Eisen gemessen wurde (II) Gehalt bestimmt durch eine Standardkurve.

Durch Eisenionen-Redoxreaktionen erzeugte LPOs wurden durch einen kolorimetrischen Assay (Cayman Chemical, 705003) gemäß dem Protokoll des Herstellers gemessen. Kurz gesagt, Gesamt-ECs wurden aus den Knochen junger und älterer Mäuse isoliert, die mit Vehikel oder E2 behandelt wurden, wie zuvor erläutert, unter Verwendung von Dynabeads und nach Entfernung der Kügelchen durch Ultraschall lysiert. Es folgte eine Methanol-Chloroform-Extraktion, wobei die Chloroformschicht zur Reaktion mit Thiocyanat-Ionen verwendet wurde, um LPOs zu erkennen, die durch Messung der OD bei 500 nm mit dem FLUOstar Omega Microplate Reader 3.0 erzeugt wurden.

Die Konzentration von 17β-Östradiol wurde aus Blutserum durch einen ELISA (Abcam, ab108667) gemäß dem Protokoll des Herstellers bestimmt. Um Serum zu erhalten, wurde zirkulierendes Blut von Mäusen gesammelt und 45–60 Minuten lang bei Raumtemperatur gerinnen gelassen und dann 10 Minuten lang bei 3.500 U/min zentrifugiert. Das 17β-Östradiol-HRP-Konjugat wurde zu Proben oder Standards gegeben und 2 Stunden lang bei 37 °C inkubiert. Nach dem Waschen aller Proben wurde TMB-Substrat hinzugefügt und weitere 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Die Reaktion wurde durch Zugabe einer Stopplösung gestoppt und die OD bei 450 nm gemessen, um die E2-Konzentration mithilfe einer Standardkurve zu quantifizieren.

Der Überstand wurde von kultivierten BECs gesammelt, die mit Vehikel (DMSO) oder 17β-Östradiol behandelt wurden, um die Konzentration von TNFα (R&D Systems, MTA00B) und IL-6 (R&D Systems, M6000B) zu messen, die mithilfe von ELISA gemäß dem Protokoll des Herstellers freigesetzt wurden. Konkret wurde den Standards oder Proben Assay-Verdünnungsmittel zugesetzt und 2 Stunden lang bei Raumtemperatur inkubiert. Nach dem Waschen aller Proben wurde das jeweilige Proteinkonjugat 2 Stunden lang zugegeben, gefolgt von weiterem Waschen und 30-minütiger Inkubation mit Substratlösung. Die OD wurde bei 540 nm und 450 nm gemessen (zur Wellenlängenkorrektur subtrahiert) und die Proteinkonzentrationen wurden anhand einer Standardkurve bestimmt.

Die Femuren wurden herauspräpariert und mit Mörser und Stößel in eiskaltem PBS zerstoßen. Die Knochenmarklösung wurde durch einen 100-μm-Filter geleitet und pelletiert. Die RBC-Lyse (ChemCruz) folgte wie oben erläutert. Die Zellen wurden in PBS resuspendiert und auf Gesamt-ECs gefärbt: primärer Antikörper CD45 (BD Pharmingen, 1:100) oder Typ-H-ECs: primärer Antikörper Endomucin (Santa Cruz Biotechnology, 1:50) und sekundärer Antikörper Brilliant Violet-421 (Jackson ImmunoResearch). , 1:50) zusammen mit CD31-PE (Miltenyi Biotec, 1:20) oder CD31-APC (Miltenyi Biotec, 1:20). Die Mitochondrienfärbung wurde nach 15-minütiger Antikörperinkubation mit MitoSOX (Thermo Fisher Scientific, 1 μM) bei 37 °C durchgeführt. Die Zellen wurden mit der Software BD FACSDiva 9.0.0 durch das BD LSR II-Durchflusszytometer laufen gelassen.

Für die FABP4-Färbung wurde nach der primären Anti-CD45-Inkubation Anti-FABP4-AF488 (Santa Cruz Biotechnology, 1:50) zusammen mit Anti-CD31-PE hinzugefügt.

Für die Ki-67-Färbung wurden die Zellen wie oben für das Gesamtendothel erläutert gefärbt. Nach der sekundären Antikörperfärbung und dem Waschen wurden die Zellen fixiert, permeabilisiert (0,1 % BSA und 0,01 % Saponin) und mit FITC-Anti-Maus-Ki-67 (BioLegend, 1:75) 45 Minuten lang bei Raumtemperatur gefärbt und die Zellen wurden aufgenommen ein BD LSR II Durchflusszytometer.

Um intrazelluläre Eisenionen nachzuweisen, wurden die Zellen nach der Färbung auf Gesamt-ECs 15 Minuten lang bei 37 °C mit FeRhoNox-1 (Goryo Chemical, 5 μM) inkubiert.

BECs in Kultur, behandelt mit Vehikel (DMSO) oder 17β-Östradiol (10 μM), wurden trypsinisiert, pelletiert und entweder mit BODIPY 558/568 C12 (Thermo Fisher Scientific, 1 μM) oder HCS LipidTOX Green (Thermo Fisher Scientific, 1: 1.000) für 30 Minuten bei 37 °C vor der Erfassung.

Für den LPO-Sensor wurden die Zellen auf Gesamtendothel gefärbt und dann vor der Erfassung 30 Minuten lang bei 37 °C mit BODIPY 665/676 (Thermo Fisher Scientific, 2 μg ml–1) inkubiert.

Die gesamte Durchflusszytometrieanalyse wurde mit der Software FlowJo 10.0.0 durchgeführt. Die Gesamt-ECs wurden für CD31+CD45−Ter119−-Populationen und Typ-H-ECs für Emcnhigh/CD31high-Populationen kontrolliert.

Für alle Radioisotopenmarkierungsexperimente wurden BECs mit etwa 25.000 Zellen pro Vertiefung ausgesät und vor der Radiomarkierung 48 Stunden lang mit Vehikel (DMSO) oder 17β-Östradiol behandelt. Um die Glucose- und Glutaminoxidation zu messen, wurden die Zellen mit 0,3 μCi/ml D-[6-14C]-Glucose (PerkinElmer) oder 1,1 μCi/ml L-[14C(U)]-Glutamin (PerkinElmer) in Zellkulturmedium inkubiert 6 Stunden. Um den Zellstoffwechsel zu stoppen, wurden 250 μl Perchlorsäure in jede Vertiefung gegeben und zusätzlich ein mit Hyaminhydroxid getränktes Filterpapier hinzugefügt, um das durch Glucose- oder Glutaminoxidation über Nacht bei Raumtemperatur freigesetzte 14CO2 zu absorbieren. Die Radioaktivität wurde durch Flüssigszintillationszählung bestimmt, um die Zerfälle pro Minute anzugeben. Für die FA-Oxidationsstudie wurde Etomoxir wie zuvor beschrieben zur Hemmung von CPT1A verwendet. Um die Palmitatoxidation zu messen, wurden die Zellen 6 Stunden lang mit 2 μCi/ml [9,10-3H]-Palmitinsäure (PerkinElmer) im Zellkulturmedium inkubiert. Das Zellkulturmedium wurde in Glasfläschchen mit hängendem Filterpapier überführt, um das über 48 Stunden bei 37 °C freigesetzte 3H2O zu absorbieren. Die Radioaktivität wurde durch Flüssigkeitsszintillationszählung (QuantaSmart) bestimmt, um Zerfälle pro Minute anzugeben.

Z-Stapel von Bildern wurden in 3D rekonstruiert und mit der Imaris Image Analysis-Software Version 9.0.0 analysiert. Die Quantifizierung des Perilipin+- und Typ-H-Bereichs erfolgte mit ImageJ (Fidschi) auf der maximalen Projektion von Z-Stapeln. Die Anzahl der Osterix+-Zellen wurde mithilfe der Spoterkennungsfunktion automatisch gezählt, indem mithilfe von Imaris ein Schwellenwertdurchmesser für Osrerix+-Kerne festgelegt wurde, um einen Hintergrund auszuschließen. Das Gefäßvolumen des Typs H wurde mithilfe der Oberflächenfunktion quantifiziert, um 3D-Überlappungen von Emcn+CD31+-Volumina in Imaris zu erzeugen. EdU+-ECs wurden mithilfe der Fleckenfunktionserkennung in Imaris automatisch gezählt, ähnlich wie Osterix+-Kerne, nachdem mithilfe der Oberflächenfunktion eine Maske für Emcn+-Blutgefäße angewendet wurde. Ki-67+ ECs wurden auf ähnliche Weise quantifiziert. Die mittlere Fluoreszenzintensität (MFI) für Emcn+ 4-HNE und FABP4 wurde während der 3D-Rekonstruktion von Z-Stapeln für die Volumenanalyse automatisch generiert, indem eine Maske für Emcn+-Gefäße erstellt wurde. CD31+Ki-67+-Zellkerne wurden mit der Zellzählerfunktion in ImageJ (Fidschi) gezählt. CD31+ 4-HNE (MFI) für Zellen wurde in ImageJ (Fidschi) unter Verwendung der integrierten Dichte und der mittleren Grauwerte generiert. Die Hintergrundfluoreszenz wurde subtrahiert, um über mehrere Bilder hinweg eine korrigierte Fluoreszenzintensität pro Zelle zu erhalten. Plin+ ATGL und HSL (MFI) wurden auf ähnliche Weise berechnet, wobei die integrierte Dichte und die mittleren Grauwerte pro Lipidtröpfchen über mehrere Bilder für 4–5 Knochenproben verwendet wurden.

ECs wurden mit Antikörper-beschichteten Perlen isoliert, wie oben erläutert. Anstatt Zellen für die Kultur auszuplattieren, wurden die Zellen mit RLT-Puffer (Qiagen) lysiert und die RNA mit dem RNeasy Plus Micro Kit (Qiagen, 74034) gemäß den Richtlinien des Herstellers extrahiert. Die Gesamt-RNA wurde mit dem iScript cDNA Synthesis Kit (Bio-Rad) gemäß den Kit-Anweisungen in cDNA umgewandelt. Verdünnte cDNA wurde für qPCR verwendet, das unter Verwendung von SYBR Green Master Mix (Thermo Fisher Scientific) mit Primern für die folgenden Gene durchgeführt wurde: Tgfb, Eng, Tie1, Pecam1, Itga5, Flt4, Flt1, Fgfr2, Sox18, Nrp1, Adipoq, Fabp4, Cyp1b1, Lepr, Aldh1a2, TNFα und Il6. β-Actin wurde als Haushaltsgen verwendet.

Um den Verlust der Genfunktion auf Transkriptebene für Gen-Deletionsexperimente zu bestätigen, wurden ECs aus den Oberschenkelknochen von mit Tamoxifen injizierten transgenen Mäusen für qPCR isoliert, wobei Primer für jedes Gen (Esr1, Esr2, Gper1 und Cpt1a) verwendet wurden. Die in dieser Studie verwendeten Primersequenzen sind in der Ergänzungstabelle 1 aufgeführt.

Die Reaktionen wurden auf einem CFX-Echtzeit-PCR-Gerät (Bio-Rad) unter Verwendung der CFX-Manager-3.1-Software durchgeführt. Die Daten wurden mithilfe der ΔΔCt-Methode berechnet, um die Fold-Genexpression oder die relativen mRNA-Spiegel anzuzeigen.

Isolierte Knochen-ECs wurden mit RLT-Puffer lysiert. Die RNA wurde mit dem RNeasy Plus Micro Kit gemäß den Richtlinien des Herstellers extrahiert.

Die Qualität der RNA für jede einzelne Probe wurde mit einem 2100 Bioanalyzer (Agilent) überprüft. Die drei besten Proben aus jedem Satz, basierend auf der RNA-Qualität, wurden für die Bibliotheksvorbereitung weiterverarbeitet. Zur Vorbereitung der Bibliotheken wurde das TruSeq Total RNA Library Prepared Kit (Illumina) gemäß den Richtlinien des Herstellers verwendet. Die Bibliotheken wurden in der LMS Genomics Facility auf einer Illumina HiSeq 2500-Plattform mit Paired-End-Reads mit einer Länge von 100 Nukleotiden sequenziert.

Datenanalyse: Paired-End-100-bp-RNA-seq-Reads wurden mithilfe der Mausgenomassemblierung GRCm39 STAR (Version 2.7.10a)45 ausgerichtet. Die genbasierte Lesezahl wurde mit featureCounts (Version 2.0.1)46 ermittelt. Die Zähldaten wurden mithilfe der Varianzstabilisierungstransformationsfunktion (VST) aus dem DESeq2-Paket47 zur Visualisierung durch PCA normalisiert. Mit DESeq2 wurde eine differenzielle Genexpressionsanalyse zwischen Männern und Frauen für jede Altersgruppe durchgeführt. DE-Gene wurden unter Verwendung eines an die Falscherkennungsrate (FDR) angepassten P < 0,05 ausgewählt (Proteinkodierung). Darüber hinaus wurden die Ensembl-IDs mithilfe von biomaRt (Lit. 48) mit Gensymbolen und der Entrez-Gen-ID annotiert. Die Liste der differenziell regulierten Gene ist im Ergänzungsdatensatz 1 enthalten. Die Gen-Set-Anreicherungsanalyse wurde mit GAGE ​​(Version 2.42.0)19 durchgeführt. Für die funktionelle Annotation verwendeten wir Gensätze aus der KEGG-Datenbank. Die GAGE-Analyse wurde an differenziell regulierten Genen aus Daten von 65 Wochen durchgeführt, wobei die weibliche Probe als Referenzprobe entnommen wurde. Die signifikanten KEGG-Terme wurden mit P <0,05 ausgewählt.

Für die Erstellung aller Diagramme und für die statistische Analyse wurde GraphPad Prism Version 9.4.1 verwendet. Die für jede Figur durchgeführten Statistiken werden in der entsprechenden Figurenlegende erwähnt. Wo angegeben, wurden für Datensätze zweiseitige ungepaarte t-Tests nach Student oder eine einfaktorielle oder zweifaktorielle ANOVA nach Tukeys Mehrfachvergleichstest durchgeführt. Fehlerbalken für biologische Daten geben den Mittelwert ± Standardabweichung an, und für die numerische Quantifizierung zeigen Fehlerbalken den Mittelwert ± Standardabweichung an. P < 0,05 wurde als statistisch signifikant angesehen. Die Stichprobengrößen wurden auf der Grundlage früherer Experimente und veröffentlichter Daten ausgewählt. Alle Daten wurden mithilfe von mindestens zwei unabhängigen Experimenten generiert, um ähnliche Ergebnisse zu reproduzieren.

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Research Reporting Summary.

Die für diese Studie generierten RNA-seq-Daten wurden in der National Center for Biotechnology Information Gene Expression Omnibus-Datenbank unter den Zugangsnummern GSE163515 und GSE180246 hinterlegt. Zusätzliche Daten, die die Ergebnisse dieser Studie stützen, sind im Hauptartikel und den zugehörigen Dateien enthalten. Quelldaten werden mit diesem Dokument bereitgestellt.

Clarke, BL & Khosla, S. Weibliches Fortpflanzungssystem und Knochen. Bogen. Biochem. Biophys. 503, 118–128 (2010).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Khosla, S. & Monroe, DG Regulierung des Knochenstoffwechsels durch Sexualsteroide. Kalter Frühling Harb. Perspektive. Med. 8, a031211 (2018).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Nakada, D. et al. Östrogen erhöht die Selbsterneuerung hämatopoetischer Stammzellen bei Frauen und während der Schwangerschaft. Natur 505, 555–558 (2014).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Zhou, S. et al. Östrogene aktivieren die Transkription des knochenmorphogenetischen Protein-2-Gens in mesenchymalen Stammzellen der Maus. Mol. Endokrinol. 17, 56–66 (2003).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Sivan, U., De Angelis, J. & Kusumbe, AP Rolle angiokriner Signale bei der Knochenentwicklung, Homöostase und Krankheit. Öffnen Sie Biol. 9, 190144 (2019).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Hendriks, M. & Ramasamy, SK Blutgefäße und Gefäßnischen bei der Knochenentwicklung und dem physiologischen Umbau. Vorderseite. Zellentwickler. Biol. 8, 602278 (2020).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Chen, J., Hendriks, M., Chatzis, A., Ramasamy, SK & Kusumbe, AP Knochengefäßsystem und Knochenmarkgefäßnischen in Gesundheit und Krankheit. J. Bone Miner. Res. 35, 2103–2120 (2020).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Kusumbe, AP, Ramasamy, SK, Starsichova, A. & Adams, RH Probenvorbereitung für die hochauflösende konfokale 3D-Bildgebung von Mausskelettgewebe. Nat. Protokoll. 10, 1904–1914 (2015).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Kusumbe, AP, Ramasamy, SK & Adams, RH Kopplung von Angiogenese und Osteogenese durch einen spezifischen Gefäßsubtyp im Knochen. Natur 507, 323–328 (2014).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Ramasamy, SK, Kusumbe, AP, Wang, L. & Adams, RH Die Aktivität der Endothelial Notch fördert die Angiogenese und Osteogenese im Knochen. Natur 507, 376–380 (2014).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Borman, SM, Christian, PJ, Sipes, IG & Hoyer, PB Ovotoxizität bei weiblichen Fischer-Ratten und B6-Mäusen, hervorgerufen durch niedrig dosierte Exposition gegenüber drei polyzyklischen aromatischen Kohlenwasserstoffen: Vergleich durch Berechnung eines ovotoxischen Index. Toxicol. Appl. Pharmakol. 167, 191–198 (2000).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Brooks, HL, Pollow, DP & Hoyer, PB Das VCD-Mausmodell der Menopause und Perimenopause zur Untersuchung von Geschlechtsunterschieden bei Herz-Kreislauf-Erkrankungen und dem metabolischen Syndrom. Physiology (Bethesda) 31, 250–257 (2016).

CAS Google Scholar

Kalu, DN Das ovarektomierte Rattenmodell des postmenopausalen Knochenverlusts. Knochenbergmann. 15, 175–191 (1991).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Feng, Y., Manka, D., Wagner, KU & Khan, SA Die Östrogenrezeptor-α-Expression im Brustepithel ist für die duktale und alveoläre Morphogenese bei Mäusen erforderlich. Proz. Natl Acad. Wissenschaft. USA 104, 14718–14723 (2007).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Maneix, L. et al. Östrogenrezeptor-β-Exon-3-deletierte Maus: Die Bedeutung von Nicht-ERE-Signalwegen bei der ERβ-Signalübertragung. Proz. Natl Acad. Wissenschaft. USA 112, 5135–5140 (2015).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Wang, H. et al. Die kardiomyozytenspezifische Deletion des G-Protein-gekoppelten Östrogenrezeptors (GPER) führt zu einer linksventrikulären Dysfunktion und unerwünschtem Remodeling: eine geschlechtsspezifische Genprofilanalyse. Biochim. Biophys. Acta Mol. Basisdis. 1863, 1870–1882 (2017).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Wang, Y. et al. Ephrin-B2 steuert die VEGF-induzierte Angiogenese und Lymphangiogenese. Natur 465, 483–486 (2010).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Romeo, SG et al. Endotheliale proteolytische Aktivität und Interaktion mit nicht resorbierenden Osteoklasten vermitteln die Knochenverlängerung. Nat. Zellbiol. 21, 430–441 (2019).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Luo, W., Friedman, MS, Shedden, K., Hankenson, KD & Woolf, PJ GAGE: allgemein anwendbare Gen-Set-Anreicherung für die Signalweganalyse. BMC Bioinformatics 10, 161 (2009).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

De Bock, K. et al. Rolle der PFKFB3-gesteuerten Glykolyse bei der Gefäßkeimung. Zelle 154, 651–663 (2013).

Artikel PubMed Google Scholar

Schoors, S. et al. Fettsäurekohlenstoff ist für die dNTP-Synthese in Endothelzellen essentiell. Natur 520, 192–197 (2015).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Huang, H. et al. Rolle des Glutamin- und miteinander verbundenen Asparaginstoffwechsels bei der Gefäßbildung. EMBO J. 36, 2334–2352 (2017).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Shafat, MS et al. Leukämische Blasten programmieren Knochenmark-Adipozyten, um eine protumorale Mikroumgebung zu erzeugen. Blut 129, 1320–1332 (2017).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Kusumbe, AP et al. Altersabhängige Modulation von Gefäßnischen für hämatopoetische Stammzellen. Natur 532, 380–384.

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Ramasamy, SK et al. Der Blutfluss steuert die Knochengefäßfunktion und die Osteogenese. Nat. Komm. 7, 13601 (2016).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Devlin, MJ & Rosen, CJ Die Knochen-Fett-Grenzfläche: grundlegende und klinische Auswirkungen der Markadipositas. Lancet Diabetes Endocrinol. 3, 141–147 (2015).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Kawai, M., de Paula, FJ & Rosen, CJ Neue Erkenntnisse zur Osteoporose: der Knochen-Fett-Zusammenhang. J. Intern. Med. 272, 317–329 (2012).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Cooke, PS & Naaz, A. Rolle von Östrogenen bei der Entwicklung und Funktion von Adipozyten. Exp. Biol. Med. (Maywood) 229, 1127–1135 (2004).

Artikel CAS Google Scholar

Okazaki, R. et al. Östrogen fördert die frühe Osteoblastendifferenzierung und hemmt die Adipozytendifferenzierung in Stromazelllinien des Knochenmarks der Maus, die den Östrogenrezeptor (ER) α oder β exprimieren. Endocrinology 143, 2349–2356 (2002).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Goodman-Gruen, D. & Barrett-Connor, E. Geschlechtsunterschiede im Zusammenhang zwischen endogenen Sexualhormonspiegeln und Glukosetoleranzstatus bei älteren Männern und Frauen. Diabetes Care 23, 912–918 (2000).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Carani, C. et al. Wirkung von Testosteron und Östradiol bei einem Mann mit Aromatasemangel. N. engl. J. Med. 337, 91–95 (1997).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Ferrini, RL & Barrett-Connor, E. Sexualhormone und Alter: eine Querschnittsstudie zu Testosteron und Östradiol und ihren bioverfügbaren Anteilen bei in Wohngemeinschaften lebenden Männern. Bin. J. Epidemiol. 147, 750–754 (1998).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Lindle, RS et al. Alters- und Geschlechtsvergleiche der Muskelkraft bei 654 Frauen und Männern im Alter von 20–93 Jahren. J. Appl. Physiol. (1985) 83, 1581–1587 (1997).

Artikel CAS Google Scholar

Hofbauer, LC et al. Östrogen stimuliert die Genexpression und Proteinproduktion von Osteoprotegerin in menschlichen Osteoblastenzellen. Endocrinology 140, 4367–4370 (1999).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Bord, S., Irland, DC, Beavan, SR & Compston, JE Die Auswirkungen von Östrogen auf die Expression von Osteoprotegerin, RANKL und Östrogenrezeptoren in menschlichen Osteoblasten. Bone 32, 136–141 (2003).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Saika, M., Inoue, D., Kido, S. & Matsumoto, T. 17β-Östradiol stimuliert die Expression von Osteoprotegerin durch eine Stromazelllinie der Maus, ST-2, über den Östrogenrezeptor-α. Endocrinology 142, 2205–2212 (2001).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Streicher, C. et al. Östrogen reguliert den Knochenumsatz, indem es auf die RANKL-Expression in den Knochenauskleidungszellen abzielt. Wissenschaft. Rep. 7, 6460 (2017).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Kourtis, N. & Tavernarakis, N. Zelluläre Stressreaktionswege und Alterung: komplizierte molekulare Beziehungen. EMBO J. 30, 2520–2531 (2011).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Schaur, RJ Grundlegende Aspekte der biochemischen Reaktivität von 4-Hydroxynonenal. Mol. Aspekte Med. 24, 149–159 (2003).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Kajimoto, K., Minami, Y. & Harashima, H. Zytoprotektive Rolle des Fettsäurebindungsproteins 4 gegen oxidativen und endoplasmatischen Retikulumstress in 3T3-L1-Adipozyten. FEBS Open Bio. 4, 602–610 (2014).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Dixon, SJ et al. Ferroptose: eine eisenabhängige Form des nichtapoptotischen Zelltods. Zelle 149, 1060–1072 (2012).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Friedmann Angeli, JP et al. Die Inaktivierung des Ferroptoseregulators Gpx4 löst bei Mäusen ein akutes Nierenversagen aus. Nat. Zellbiol. 16, 1180–1191 (2014).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Syed, FA et al. Auswirkungen der Östrogentherapie auf Knochenmarks-Adipozyten bei postmenopausalen osteoporotischen Frauen. Osteoporos. Int. 19, 1323–1330 (2008).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Chen, J. et al. Hochauflösende 3D-Bildgebung deckt die organspezifische Gefäßkontrolle der Gewebealterung auf. Wissenschaft. Adv. 7, eabd7819 (2021).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Dobin, A. et al. STAR: ultraschneller universeller RNA-seq-Aligner. Bioinformatik 29, 15–21 (2013).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Liao, Y., Smyth, GK & Shi, W. featureCounts: ein effizientes Allzweckprogramm zum Zuweisen von Sequenzablesungen zu genomischen Merkmalen. Bioinformatik 30, 923–930 (2014).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Love, MI, Huber, W. & Anders, S. Moderierte Schätzung der Faltungsänderung und Streuung für RNA-seq-Daten mit DESeq2. Genombiol. 15, 550 (2014).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Durinck, S., Spellman, PT, Birney, E. & Huber, W. Mapping-Identifikatoren für die Integration genomischer Datensätze mit dem R/Bioconductor-Paket biomaRt. Nat. Protokoll. 4, 1184–1191 (2009).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Referenzen herunterladen

Wir danken P. Carmeliet, SA Khan und RH Adams für die Bereitstellung von Mauslinien und P. Carmeliet und G. Eelen für die Bereitstellung des radioaktiven Testprotokolls. Wir danken R. Eastell, I. Miguel-Aliaga und allen Mitgliedern des Ramasamy-Labors für aufschlussreiche Diskussionen. SKR ist Sir Henry Dale Fellow des Wellcome Trust und der Royal Society (202300/Z/16/Z). SKR erkennt an, dass diese Forschung teilweise vom Wellcome Trust (202300/Z/16/Z), der Royal Society (RGS\R2\212421), dem Medical Research Council (A654-5QC60) und der American Society for Bone and finanziert wurde Mineralforschung. APK erkennt an, dass die Arbeit teilweise vom Medical Research Council (CDA: MR/P02209X/1) und dem European Research Council (StG: metaNiche, 805201) unterstützt wird. SKR ist Mitglied des EMBO Young Investigator Programme. Zum Zweck des offenen Zugangs haben wir auf jede vom Autor akzeptierte Manuskriptversion, die sich aus dieser Einreichung ergibt, eine öffentliche CC BY-Urheberrechtslizenz angewendet.

Institut für klinische Wissenschaften, Imperial College London, London, Großbritannien

Julia Rodrigues, Michelle Hendriks und Saravana K. Ramasamy

MRC London Institute of Medical Sciences, Imperial College London, London, Großbritannien

Julia Rodrigues, Michelle Hendriks und Saravana K. Ramasamy

Bioinformatik- und Computereinrichtung, MRC London Institute of Medical Sciences, Imperial College London, London, Großbritannien

Yi-Fang Wang & Gopuraja Dharmalingam

Tissue and Tumor Microenvironments Group, MRC Human Immunology Unit, MRC Weatherall Institute of Molecular Medicine, Universität Oxford, Oxford, Großbritannien

Amit Singh & Anjali P. Kusumbe

Biochemisches Zentrum der Universität Heidelberg, Universität Heidelberg, Heidelberg, Deutschland

Amit Singh

Bioscar Inserm U1132 und Universität Paris, Krankenhaus Lariboisiere, Paris, Frankreich

Martine Cohen-Solal

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

JR hat die meisten Experimente entworfen und durchgeführt, die Ergebnisse interpretiert und Zahlen erstellt. Y.-FW, AS und GD analysierten Genexpressionsdaten. MH sortierte die Zellen und bereitete das Manuskript vor. APK hat Experimente entworfen und Ergebnisse interpretiert. Alle Autoren haben das Manuskript erstellt. SKR konzipierte und überwachte die Studie, interpretierte die Ergebnisse und verfasste das Manuskript.

Korrespondenz mit Saravana K. Ramasamy.

Die Autoren geben an, dass keine konkurrierenden finanziellen Interessen bestehen.

Nature Cardiocular Research dankt Philip Shaul, Joshua Farr und den anderen, anonymen Gutachtern für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

a, Repräsentative konfokale Bilder, die Veränderungen in OBLs (Osterix+) und Knochenmarks(BM)-Adipozyten (Perilipin+) zu verschiedenen Zeitpunkten während der Mausschwangerschaft und nach der Geburt zeigen. Maßstabsbalken 40 μm. b, Quantifizierung der in a beschriebenen OBLs und BM-Adipozyten, normalisiert auf die Länge bzw. Fläche der Metaphyse (mp) (n = 5). Die Daten sind Mittelwerte ± SD; Einfaktorielle ANOVA mit Tukey-Test. c, Quantifizierung von Ki-67+ ECs zu verschiedenen Zeitpunkten während der Mausschwangerschaft, normalisiert auf die Länge von mp (n = 5). Die Daten sind Mittelwerte ± SD; Einfaktorielle ANOVA mit Tukey-Test. d, Repräsentative konfokale Bilder mit Quantifizierungen (n = 5), die den Verlust von OBLs und den Anstieg der BM-Adipozyten im VCD-Modell zeigen. Die Daten sind Mittelwerte ± SD; Ungepaarter zweiseitiger t-Test. Maßstabsbalken 40 μm. e, Repräsentative konfokale Kachelscans von Vehikel- und E2-behandelten Knochen bei P28, die erhöhte Typ-H-Gefäße (Pfeilspitzen) bei E2-behandelten Mäusen veranschaulichen. Weiße gepunktete Linien trennen das Knochenmark vom kortikalen Knochenbereich. Quantifizierung von Typ-H-ECs (CD31high Emcnhigh), charakterisiert durch Durchflusszytometrie (n = 6). Die Daten sind Mittelwerte ± Standardabweichung; Zweifaktorielle ANOVA mit Tukey-Test. Maßstabsbalken 100 μm.

Quelldaten

a, Repräsentative konfokale Bilder mit Quantifizierungen von OBLs (Osterix+, n = 5) und BM-Adipozyten (Perilipin +, n = 5) von Mäusen, die bei P28 mit verschiedenen Hormonen behandelt wurden. Die Daten sind Mittelwerte ± SD; Zweifaktorielle ANOVA mit Tukey-Test. Maßstabsbalken 40 μm. b: Repräsentative konfokale Bilder zeigen Endomucin- (Emcn, rot), CD31- (grün) und Alpha-Glattmuskel-Aktin-Blutgefäße (αSMA, Cyan) in der Metaphyse und im kortikalen Knochenbereich. Die Grafiken zeigen die Quantifizierung von CD31 + Emcn- Arteriolen (weiße Pfeilspitzen) und TCVs bei Mäusen, die mit Vehikel, E2, P4 und DHT behandelt wurden (n = 5); Die Daten sind Mittelwerte ± SD; Zweifaktorielle ANOVA mit Tukey-Test. Weiße gepunktete Linien kennzeichnen die kortikale Knochenregion. DAPI ist ein nukleares Gegenmittel. Maßstabsbalken 100 μm (TCVs); 50 μm (Arteriolen). c, Repräsentative konfokale Bilder von mit EdU injiziertem Vehikel und E2-behandelten Mäusen bei P28, mit Quantifizierung von EdU+ ECs normalisiert auf Metaphysenlänge (mp) (Vehikel n = 4 F, n = 4 M; E2 n = 5 F, n = 4 M), was auf erhöhte EdU+ ECs bei E2-Behandlung hinweist. Maßstabsbalken 50 μm. Repräsentative Durchflusszytometriediagramme von Ki-67+-ECs mit Quantifizierung von Ki-67+-ECs im Knochen (Vehikel n = 4 F, n = 4 M; E2 n = 6 F, n = 4 M), was auf einen Anstieg von Ki-67+-ECs hinweist. 67+ ECs mit E2-Behandlung. Bildquantifizierungsdaten sind Mittelwert ± Standardabweichung mit Zwei-Wege-ANOVA mit Tukey-Test und Durchflusszytometriedaten Mittelwert ± Standardabweichung mit Zwei-Wege-ANOVA mit Tukey-Test. d, Repräsentative konfokale Bilder und Quantifizierung von Ki-67+-Kernen von Vehikel- und E2-behandelten BECs (Vehikel n = 11, E2 n = 10) mit Quantifizierung des Durchschnitts aus mehreren 20-fachen Sichtfeldern, was auf einen Anstieg der Ki-67+-Zellen hinweist mit E2-Behandlung. Die Daten sind Mittelwerte ± SD; Ungepaarter zweiseitiger t-Test. Maßstabsbalken 50 μm. e, Diagramm, das die relative Genexpression für angiogene Gene in mit Vehikel und E2 behandelten Mäusen zeigt, was auf einen Anstieg der Angiogenese bei E2-Behandlung hinweist. (Tgfb Fahrzeug n = 8, E2 n = 5; Eng Fahrzeug n = 8, E2 n = 5; Tie1 Fahrzeug n = 6, E2 n = 5; Pecam1 Fahrzeug n = 8, E2 n = 5; Itga5 Fahrzeug n = 7 , E2 n = 5; Flt4 Fahrzeug n = 8, E2 n = 5; Flt1 Fahrzeug n = 5, E2 n = 4; Fgfr2 Fahrzeug n = 7, E2 n = 6; Sox18 Fahrzeug n = 8, E2 n = 8; Nrp1 Fahrzeug n = 7, E2 n = 6.) Daten sind Mittelwerte ± Standardabweichung; Mehrfacher ungepaarter zweiseitiger t-Test.

Quelldaten

a, Diagramm, das die Serum-E2-Konzentration zu verschiedenen Zeitpunkten während der Mausschwangerschaft zeigt (n = 6 für dpc10.5, dpc17.5; n = 5 für männlich, jungfräulich F, dpc5.5, dpp0, dpp7). Die Daten sind Mittelwerte ± Standardabweichung; Einfaktorielle ANOVA mit Tukey-Test. b, Diagramm, das die Serum-E2-Konzentration in P28-Mäusen (n = 4 F, n = 4 M) und alten Mäusen (n = 8 F, n = 7 M) zeigt. Die Daten sind Mittelwerte ± Standardabweichung; Zweifaktorielle ANOVA mit Tukey-Test. c, Repräsentative konfokale Bilder mit Quantifizierungen von Typ-H-Blutgefäßen (gelb, Emcnhigh CD31high) (n = 5 für alle Bedingungen), OBLs (Osterix +, n = 5) und BM-Adipozyten (Perilipin +, n = 5) in Mit Vehikel und E2 behandelte scheinoperierte und OVX-Mäuse. Die durchflusszytometrische Quantifizierung der gesamten ECs (CD31 + CD45-Ter119-) zeigt die Erholung von BECs in E2-behandelten Knochen (n = 5). Bei den Daten handelt es sich um Mittelwerte ± Standardabweichung für die Bildquantifizierung und Mittelwerte ± Standardabweichung für Durchflusszytometriedaten. Zweifaktorielle ANOVA mit Tukey-Test. Maßstabsbalken 50 μm. d, Knochengewebeschnitte von mit Vehikel und Letrozol behandelten Mäusen bei P28 wurden mit CD31 (grün) und Emcn (rot) immungefärbt, um Typ-H-Gefäße zu identifizieren. Die Grafik zeigt Quantifizierungen von Typ-H-Blutgefäßen (gelb) (n = 4). Die Verteilung von OBLs und BM-Adipozyten in diesen Knochenabschnitten wurde mit Osterix + (Cyan) und Perilipin (Grün) abgebildet. Die Grafiken zeigen die Quantifizierung von OBLs (n = 4) und Adipozyten (n = 4) in mit Vehikel und Letrozol behandelten Mäusen. Die Daten sind Mittelwerte ± SD; Zweifaktorielle ANOVA mit Tukey-Test. Maßstabsbalken 50 μm.

Quelldaten

a, Diagramme, die die relativen mRNA-Spiegel von Östrogenrezeptoren (Esr1, Esr2, Gper1) in weiblichen und männlichen BECs bei P28 zeigen. (Esr1: n = 8 F, n = 7 M; Esr2, Gper1: n = 7) Daten sind Mittelwerte ± Standardabweichung; Ungepaarter zweiseitiger t-Test. b, Diagramme, die die ER-Transkriptniveaus in gereinigten BECs von endothelialen Esr1-, Esr2- oder Gper1-Deletionsmutanten und Kontroll-Wurfgeschwistern zeigen (Esr1-Kontrolle n = 6 F, n = 6 M, Mutante n = 5 F, n = 5 M; Esr2-Kontrolle n). = 5 F, n = 5 M, Mutante n = 6 F, n = 5 M; Gper1-Kontrolle n = 5 F, n = 6 M, Mutante n = 5 F, n = 6 M). Die Daten sind Mittelwerte ± Standardabweichung; Zweifaktorielle ANOVA mit Tukey-Test. c, Repräsentative konfokale Bilder von Mutanten mit endothelialer Esr1-, Esr2- oder Gper1-Deletion im Vergleich zu Wurfgeschwister-Cre-Kontrollen, mit Quantifizierungen, die den Verlust von OBLs und einen Anstieg der Adipozyten nach Esr1- und Gper1-Deletion zeigen (Esr1:Osx-Kontrolle n = 10 F, n = 7 M, Mutante n = 9 F, n = 6 M; Esr1:Plin-Kontrolle n = 9 F, n = 8 M, Mutante n = 8 F, n = 8 M; Esr2:Osx-Kontrolle n = 5 F, n = 5 M, Mutante n = 6 F, n = 5 M; Esr2:Plin-Kontrolle n = 5 F, n = 5 M, Mutante n = 6 F, n = 6 M; Gper1: sowohl Osx als auch Plin- Kontrolle n = 6 F, n = 7 M, Mutante n = 7 F, n = 7 M). Die Daten sind Mittelwerte ± SD; Zweifaktorielle ANOVA mit Tukey-Test. Maßstabsbalken 40 μm.

Quelldaten

a, Repräsentative microCT-Analyse von Mutanten mit endothelialer Esr1-Deletion im Vergleich zu Wurfgeschwister-Cre-Kontrollen, mit Quantifizierungen, die den trabekulären Knochenvolumenanteil (BV/TV), Anzahl, Dicke und Trennung (n = 4) sowie Quantifizierung von Adipozyten (n = 4) zeigen. und Quantifizierung der Dicke und Fläche des kortikalen Knochens (n ​​= 4). Repräsentative konfokale Bilder zeigen die Osteoklastenverteilung in Kontroll- und mutierten Knochen mit Quantifizierung der Osteoklastenanzahl (n = 6) und -abdeckung (n = 5). Bei den Daten handelt es sich um Mittelwerte ± Standardabweichung für Mikro-CT-Ergebnisse und ± Standardabweichung für die Bildquantifizierung. Zweifaktorielle ANOVA mit Tukey-Test. Maßstabsbalken 100 μm (microCT), 50 μm (konfokal). b, Repräsentative Mikro-CT-Bilder von Mutanten mit endothelialer Gper1-Deletion im Vergleich zu Wurfgeschwister-Cre-Kontrollen, mit Quantifizierungen, die den trabekulären Knochenvolumenanteil (BV/TV), Anzahl, Dicke und Trennung (n = 4) sowie Quantifizierung der Adipozyten (n = 4) zeigen ) und Quantifizierung der Dicke und Fläche des kortikalen Knochens (n ​​= 4). Repräsentative konfokale Bilder zeigen die Osteoklastenverteilung in Kontroll- und mutierten Knochen mit Quantifizierung der Osteoklastenanzahl (n = 6) und -abdeckung (n = 5). Bei den Daten handelt es sich um Mittelwerte ± Standardabweichung für Mikro-CT-Ergebnisse und ± Standardabweichung für die Bildquantifizierung. Zweifaktorielle ANOVA mit Tukey-Test. Maßstabsbalken 100 μm (microCT), 50 μm (konfokal).

Quelldaten

a, PCA-Diagramm von RNAseq-Daten, das die Häufung gereinigter männlicher und weiblicher BECs von 2 Wochen, 12 Wochen und 65 Wochen alten Mäusen (n = 3) zeigt. Beispielhafte Korrelations-Heatmaps des Genexpressionsmusters zeigen die Häufung von Altersgruppen. b: Heatmap, die Gene zeigt, die mit dem Fettsäurestoffwechsel assoziiert sind und in gealterten Maus-BECs zwischen Männern und Frauen unterschiedlich exprimiert werden. c, Repräsentative konfokale Bilder, die Zelltypen innerhalb der BM-Mikroumgebung von Cpt1a-Mutanten zeigen, mit Diagrammen, die die Quantifizierung von Osterix+-Zellen pro mm MP zeigen (Kontrolle n = 6 F, n = 7 M; Mutante n = 6 F, n = 6 M); Perilipin+-Fläche pro mm2-Fläche (Kontrolle n = 5 F, n = 6 M; Mutante n = 5 F, n = 5 M). Repräsentative MikroCT-Bilder mit Quantifizierung zeigen einen Anstieg des BM-Adipozytenvolumens in Cpt1a-Mutanten (n = 4). Bei den Daten handelt es sich um Mittelwerte ± Standardabweichung für die Bildquantifizierung und Mittelwerte ± Standardabweichung für MikroCT-Daten. Zweifaktorielle ANOVA mit Tukey-Test. Maßstabsbalken 100 μm (microCT), 40 μm (konfokal). d, Repräsentative konfokale Bilder zeigen Osx+-Zellen und Perilipin+-Adipozyten in männlichen Kontrollmäusen und Cpt1aiΔEC-Mutantenmäusen, die mit E2 behandelt wurden. Die Diagramme zeigen Quantifizierungen von Osx+-Zellen pro mm MP (n = 5) und Perilipin+-Zellen pro mm2 (n = 5). Die Daten sind Mittelwerte ± SD; Zweifaktorielle ANOVA mit Tukey-Test. Maßstabsbalken 50 μm.

Quelldaten

a, Immunfärbungen zeigen die FABP4-Expression (grün) in Blutgefäßen (Emcn, rot) der mit Vehikel und E2 behandelten Tibia sowohl männlicher als auch weiblicher Mäuse (n = 7). Maßstabsbalken 50 μm. b, Repräsentative konfokale Bilder der Lipidaufnahme von BODIPY-konjugierten synthetischen FAs in Vehikel- und E2-behandelten BECs (n = 4), wobei die Quantifizierung durch Durchflusszytometrie einen Anstieg der Lipidaufnahme bei E2-Behandlung anzeigt. Die Daten sind Mittelwerte ± Standardabweichung; Ungepaarter zweiseitiger t-Test. Maßstabsbalken 15 μm. c, Repräsentative konfokale Bilder intrazellulärer Lipidspiegel in Vehikel- und E2-behandelten BECs. Die Grafik zeigt die durchflusszytometrische Quantifizierung von BECs mit hohen LipidTOX-Werten (n = 4) unter Vehikel- und E2-Bedingungen. Die Daten sind Mittelwerte ± Standardabweichung; Ungepaarter zweiseitiger t-Test. Maßstabsbalken 15 μm. d, Repräsentative konfokale Bilder der Lipidaufnahme von BODIPY-konjugierten synthetischen FAs in Vehikel- und E2-behandelten BECs nach Behandlung mit dem GPER1-Inhibitor G36. Die Quantifizierung zeigt reduzierte Fluoreszenzeinheiten von endothelialem BODIPY nach GPER1-Hemmung über mehrere 63-fache Sichtfelder (Vehikel n = 37, Vehikel+G36 n = 30; E2 n = 39, E2 + G36 n = 30). Die Daten sind Mittelwerte ± SD; Zweifaktorielle ANOVA mit Tukey-Test. Maßstabsbalken 15 μm. e, Repräsentative konfokale Bilder und Quantifizierung der endothelialen FABP4-Spiegel in Mäusen mit Östrogenrezeptor-Deletionen Esr1 (Kontrolle n = 6 F, n = 6 M; Mutante n = 6 F, n = 6 M) und Gper1 (Kontrolle n = 6 F). , n = 6 M; Mutante n = 6 F, n = 6 M). Die Daten sind Mittelwerte ± SD; Zweifaktorielle ANOVA mit Tukey-Test. Die relativen Fabp4-Transkriptspiegel wurden auch in gereinigten Endothelzellen aus endothelialen GPER1- (n = 4) und ESR1-Mutanten (n = 4) im Vergleich zu ihrer Wurfgeschwisterkontrolle quantifiziert. Die Daten sind Mittelwerte ± Standardabweichung; Zweifaktorielle ANOVA mit Tukey-Test. Maßstabsbalken 50 μm.

Quelldaten

a, Repräsentative konfokale Bilder von BM-Adipozyten (Perilipin + -Zellen) und lipolytischen Enzymen (ATGL und HSL) in mutierten Cpt1a- und Gper1-Knochen und ihren jeweiligen Wurfgeschwistern. Maßstabsbalken 50 μm. Die Diagramme zeigen Fluoreszenzquantifizierungen, die auf eine Abnahme der lipolytischen Enzyme (ATGL und HSL) in Cpt1a hinweisen (ATGL: Kontrolle n = 23 F, 15 M; Mutante n = 23 F, 24 M. HSL-Kontrolle n = 19 F, 36 M; Mutante n = 42 F, 54 M), Gper1 (ATGL: Kontrolle n = 13 F, 12 M; Mutante n = 17 F, 21 M. HSL: Kontrolle n = 19 F, 50 M; Mutante n = 37 F, 49 M ) und Esr1 (ATGL: Kontrolle n = 75 F, 72 M; Mutante n = 63 F, 62 M. HSL: Kontrolle n = 127 F, 79 M; Mutante n = 106 F, 60 M) Deletion, pro Zelle über mehrere 20-faches Sichtfeld. Die Daten sind Mittelwerte ± SD; Zweifaktorielle ANOVA mit Tukey-Test. b, Diagramme, die die relativen Transkriptniveaus von Tnfa- und Il6-mRNA in isolierten BECs von E2-behandelten Mäusen (Vehikel n = 5 F, n = 5 M; E2 n = 5 F, n = 5 M) und die endotheliale Cpt1a- und Gper1-Deletion zeigen Mutanten (Kontrolle n = 4 F, n = 4 M; Mutante n = 4 F, n = 4 M). Die Daten sind Mittelwerte ± Standardabweichung; Zweifaktorielle ANOVA mit Tukey-Test. c, Diagramm, das erhöhte TNFα- (Fahrzeug n = 12, E2 n = 12, E2 + G36 n = 6) und IL-6-Werte (Fahrzeug n = 12, E2 n = 12, E2 + G36 n = 6) zeigt, quantifiziert aus der Zelle Kulturüberstände von BECs, behandelt mit Vehikel, E2 und E2 + G36. Die Daten sind Mittelwerte ± Standardabweichung; Einfaktorielle ANOVA mit Tukey-Test.

Quelldaten

a, Repräsentative konfokale Bilder zeigen Typ-H-Gefäße (gelb, Emcnhigh CD31high), OBLs (Osterix+) und BM-Adipozyten (Perilipin+) in alten Mäusen, die mit E2 behandelt wurden (Vehikel n = 5 F, n = 5 M; E2 n = 5 F). , n = 5 M). Maßstabsbalken 40 μm. Die Grafiken zeigen die Quantifizierung der gesamten ECs, Typ-H-Gefäße, Osx+- und Perilipin+-Zellen in Knochen von mit Vehikel und E2 behandelten Mäusen. Die Daten sind Mittelwert ± Standardabweichung für Durchflusszytometriedaten und Mittelwert ± Standardabweichung für Bildquantifizierung, Zwei-Wege-ANOVA mit Tukey-Test. b: Konfokale Bilder von Knochenabschnitten, die auf CD31 (grün), Endomucin (rot) und Alpha-Glattmuskel-Aktin (αSMA, Cyan) immungefärbt sind, zeigen die Verteilung von CD31 + Emcn-Arteriolen und TCVs in alten Mäusen, die mit Vehikel und E2 behandelt wurden. Quantifizierungsdiagramme zeigen einen Anstieg der Arteriolen und TCVs (n = 5) nach E2-Verabreichung bei Mäusen; Die Daten sind Mittelwerte ± SD; Zweifaktorielle ANOVA mit Tukey-Test. Maßstabsbalken 50 μm (Arteriolen), 100 μm (TCVs). c, Repräsentative konfokale Bilder der 4HNE-Spiegel im Knochenendothel von mit Vehikel und E2 behandelten jungen (P28; n = 8) und alten (>60 Wochen; n = 4) Mäusen. Die Bilder zeigen einen Einschub, der die endotheliale Expression von 4HNE zeigt, dargestellt durch Pfeilspitzen. Maßstabsbalken 50 μm. d, VCD-Menopausenmodell mit Einschüben, die die endotheliale Expression von 4HNE anzeigen, dargestellt durch Pfeilspitzen (Vehikel n = 5; VCD n = 5). Die Daten sind Mittelwerte ± SD; Ungepaarter zweiseitiger t-Test. Maßstabsbalken 50 μm.

Quelldaten

a: Repräsentative konfokale Bilder der endothelialen FABP4-Expression in alten Mäusen (n = 5), die einen Anstieg nach E2-Behandlung zeigen. Die Daten sind Mittelwerte ± SD; Zweifaktorielle ANOVA mit Tukey-Test. Maßstabsbalken 50 μm. b, Repräsentative konfokale Bilder mit Quantifizierung der 4HNE-Spiegel in Knochenendothelzellen, behandelt mit Vehikel und FABP4-Inhibitor BMS 309403 in Gegenwart von E2. Die Quantifizierung zeigte hohe 4HNE-Spiegel bei FABP4-Hemmung, die durch E2-Behandlung nicht wiederhergestellt wurden (n = 6). Die Daten sind Mittelwerte ± SD; Zweifaktorielle ANOVA mit Tukey-Test. Maßstabsbalken 15 μm. c, Repräsentative konfokale Bilder von BECs, die mit Control, Deferoxamin (DFM) oder Artemisinin (Art) behandelt wurden. Die Grafik zeigt die Quantifizierung der Fluoreszenzintensität endothelialer 4HNE-Spiegel (Vehikel n = 24, E2 n = 26; Vehikel+DFM n = 26; E2 + DFM n = 27; Vehikel+Art n = 21; E2 + Art n = 23). Daten sind Mittelwert ± SD; Zweifaktorielle ANOVA mit Tukey-Test. Maßstabsbalken 15 μm. d, Repräsentative konfokale Bilder mit Quantifizierung der 4HNE-Spiegel im Knochenendothel von Vehikel- (n = 5 F, n = 5 M) und DFM-behandelten Mäusen (n = 5 F, n = 6 M) bei P28. Die Daten sind Mittelwerte ± SD; Zweifaktorielle ANOVA mit Tukey-Test. Maßstabsbalken 50 μm. e: Konfokale Bilder zeigen Typ-H-Gefäße, OBLs und Perilipin-Expression in BM-Mikroumgebungen von Mäusen, die mit Artemisinin behandelt wurden (Art). Diagramme, die die Quantifizierung des Typ-H-Gefäßvolumens pro MP-Feld (Vehikel n = 4 F, n = 5 M; Artemisinin n = 4 F, n = 6 M), Osterix+-Zellen pro mm MP (Vehikel n = 5 F, n = 7 M; Artemisinin n = 5 F, n = 6 M) und Perilipin+-Fläche pro MP-Fläche (Fahrzeug n = 5 F, n = 5 M; Artemisinin n = 5 F, n = 6 M). Die Daten sind Mittelwerte ± SD; Zweifaktorielle ANOVA mit Tukey-Test. Maßstabsbalken 50 μm. f: Repräsentative microCT-3D-gerenderte Bilder zeigen kortikale Knochen älterer männlicher Mäuse, die mit Vehikel und Liproxstatin-1 (Lip-1) behandelt wurden. Die Diagramme zeigen die Dicke des kortikalen Knochens (in mm) und die kortikale Knochenfläche von älteren männlichen und weiblichen Mäusen, die mit Vehikel (n = 4 F, 4 M) und Liproxstatin-1 (n = 4 F, 4 M) behandelt wurden. Die Daten sind Mittelwerte ± Standardabweichung; Zweifaktorielle ANOVA mit Tukey-Test. Maßstabsbalken 100 μm.

Quelldaten

Ergänzende Abbildungen. 1 und 2

Genexpressionsdaten zum Vergleich männlicher und weiblicher BECs zu unterschiedlichen Zeitpunkten

In der Studie verwendete Primersequenzen

Statistische Quelldaten

Statistische Quelldaten

Statistische Quelldaten

Statistische Quelldaten

Statistische Quelldaten

Statistische Quelldaten

Statistische Quelldaten

Statistische Quelldaten

Statistische Quelldaten

Statistische Quelldaten

Statistische Quelldaten

Statistische Quelldaten

Statistische Quelldaten

Statistische Quelldaten

Statistische Quelldaten

Statistische Quelldaten

Statistische Quelldaten

Open Access Dieser Artikel ist unter einer Creative Commons Attribution 4.0 International License lizenziert, die die Nutzung, Weitergabe, Anpassung, Verbreitung und Reproduktion in jedem Medium oder Format erlaubt, sofern Sie den/die ursprünglichen Autor(en) und die Quelle angemessen angeben. Geben Sie einen Link zur Creative Commons-Lizenz an und geben Sie an, ob Änderungen vorgenommen wurden. Die Bilder oder anderes Material Dritter in diesem Artikel sind in der Creative Commons-Lizenz des Artikels enthalten, sofern in der Quellenangabe für das Material nichts anderes angegeben ist. Wenn Material nicht in der Creative-Commons-Lizenz des Artikels enthalten ist und Ihre beabsichtigte Nutzung nicht durch gesetzliche Vorschriften zulässig ist oder über die zulässige Nutzung hinausgeht, müssen Sie die Genehmigung direkt vom Urheberrechtsinhaber einholen. Um eine Kopie dieser Lizenz anzuzeigen, besuchen Sie http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Nachdrucke und Genehmigungen

Rodrigues, J., Wang, YF., Singh, A. et al. Östrogen stärkt die Integrität der Blutgefäße im Knochen während der Schwangerschaft und den Wechseljahren. Nat Cardiovasc Res 1, 918–932 (2022). https://doi.org/10.1038/s44161-022-00139-0

Zitat herunterladen

Eingegangen: 17. Januar 2022

Angenommen: 02. September 2022

Veröffentlicht: 12. Oktober 2022

Ausgabedatum: Oktober 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s44161-022-00139-0

Jeder, mit dem Sie den folgenden Link teilen, kann diesen Inhalt lesen:

Leider ist für diesen Artikel derzeit kein Link zum Teilen verfügbar.

Bereitgestellt von der Content-Sharing-Initiative Springer Nature SharedIt