Bei Brustkrebspatientinnen aus der Region Mittlerer Westen der USA ist die Zahl der Brustkrebserkrankungen reduziert

Wissenschaftliche Berichte Band 13, Artikelnummer: 526 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Da die geografische Lage das Darmmikrobiom beeinflussen kann, ist es wichtig, regionalspezifische Mikrobiomsignaturen verschiedener Krankheiten zu untersuchen. Aus diesem Grund haben wir ein Profil des Darmmikrobioms von Brustkrebspatientinnen im Mittleren Westen der USA erstellt. Die bakterielle Komponente des Darmmikrobioms wurde mithilfe der ribosomalen 16S-RNA-Sequenzierung profiliert. Zusätzlich wurde eine Genpfadanalyse durchgeführt, um die funktionellen Fähigkeiten des bakteriellen Mikrobioms zu beurteilen. Die Alpha-Diversität unterschied sich zwischen BC und gesunden Kontrollpersonen (HC) nicht signifikant, die Beta-Diversität zeigte jedoch eine deutliche Häufung zwischen den beiden Gruppen auf Arten- und Gattungsebene. Der Wilcoxon-Rangsummentest ergab, dass die Modulation mehrerer Darmbakterien in BC insbesondere die Häufigkeit derjenigen reduzierte, die mit positiven Wirkungen verbunden sind, wie z. B. Faecalibacterium prausnitzii. Die Analyse des maschinellen Lernens bestätigte die Bedeutung mehrerer der modulierten Bakterien, die in der univariaten Analyse gefunden wurden. Die Funktionsanalyse zeigte eine geringere Häufigkeit der SCFA-Produktion (Propionat) in BC im Vergleich zu HC. Zusammenfassend beobachteten wir in BC eine Darmdysbiose mit einem Rückgang der SCFA-produzierenden Darmbakterien, was auf deren Rolle in der Pathobiologie von Brustkrebs schließen lässt. Das mechanistische Verständnis der bakteriellen Darmdysbiose bei Brustkrebs könnte zu einer verfeinerten Prävention und Behandlung führen.

Die weltweite Inzidenzrate von Brustkrebs ist seit den 1980er Jahren erheblich gestiegen, und diese heterogene Erkrankung stellt heute die am häufigsten diagnostizierte Krebsart weltweit dar1. In den Vereinigten Staaten ist Brustkrebs für fast ein Drittel aller bei Frauen diagnostizierten Krebserkrankungen verantwortlich2. Es gibt zahlreiche Risikofaktoren im Zusammenhang mit Brustkrebs, darunter sowohl Umweltfaktoren (z. B. Fortpflanzungsgeschichte, Hormonersatztherapie, Fettleibigkeit usw.) als auch familiäre Faktoren (z. B. genetische Mutationen in BRCA1 und BRCA2 in der Familiengeschichte usw.)3. 4,5. Allerdings können bis zu 50 % der Brustkrebsfälle nicht auf diese bekannten Risikofaktoren zurückgeführt werden6,7, was darauf hindeutet, dass auch andere, unbekannte Faktoren zur Entstehung von Brustkrebs führen können. In jüngster Zeit konzentrierte sich die Forschung auf die Wechselwirkungen zwischen dem Wirtsmikrobiom und Krebs, obwohl die Art dieser Wechselwirkungen noch unklar ist. Obwohl bestimmte Bakterienarten mit einigen Krebsarten in Verbindung gebracht werden, wie z. B. Helicobacter pylori bei Magenkrebs und Fusobacterium nucleatum bei Darmkrebs4, gibt es kein einzelnes Bakterium, das mit der Pathobiologie von Brustkrebs in Zusammenhang steht.

Das menschliche Mikrobiom besteht aus vielen Arten von Bakterien, Viren, Pilzen und Archaeen, und Schätzungen zufolge gibt es im und auf dem menschlichen Körper mindestens so viele Mikroben wie menschliche Zellen8. Diese Mikroben stehen in einer komplexen Beziehung zum menschlichen Wirt und sind für die Homöostase von wesentlicher Bedeutung9. Bakterien stellen den am häufigsten vorkommenden Mikroorganismus dar, der den menschlichen Wirt bewohnt und mit dem Wirt durch Manipulation von Signalwegen, Hormonausschüttung, DNA-Doppelstrangbrüchen, Apoptose und Seneszenz sowie Entzündungen interagiert3,4,10. Dysbiose, eine atypische Mikrobiomzusammensetzung, wurde mit vielen Krankheitszuständen, einschließlich Krebs, in Verbindung gebracht11. Es gibt Hinweise darauf, dass Brustkrebspatientinnen eine bakterielle Dysbiose sowohl im Brustmikrobiom3 als auch im Darmmikrobiom3,5,10,12,13,14,15 haben.

Über einen Zusammenhang zwischen mikrobieller Dysbiose und Brustkrebs wurde bereits 1990 in einer Studie berichtet, in der deutlich unterschiedliche mikrobielle Zusammensetzungen im Stuhl von postmenopausalen Brustkrebspatientinnen (n = 11) im Vergleich zu gesunden Kontrollpersonen (n = 7) festgestellt wurden12. In jüngerer Zeit haben Studien deutlich unterschiedliche Darmmikrobenzusammensetzungen bei Brustkrebspatientinnen festgestellt, basierend auf dem BMI oder dem klinischen Krebsstadium16,17,18. Goedert et al. zeigten, dass postmenopausale Brustkrebspatientinnen (n = 48) im Vergleich zu gesunden Kontrollpersonen (n = 48) eine signifikant geringere Alpha-Diversität aufwiesen19. Im Gegensatz dazu haben Zhu et al. beobachteten, dass postmenopausale Brustkrebspatientinnen (n = 44) im Vergleich zu postmenopausalen gesunden Kontrollpersonen (n = 46) eine höhere Alpha-Diversität aufwiesen20. Da die Alpha-Diversität den Reichtum der Gemeinschaft beobachtet, zeigen diese Studien widersprüchliche Ergebnisse hinsichtlich der Gesamtzahl der vorhandenen Mikrobentypen. Diese Studien zeigen eine erhebliche Variabilität, aber diese Heterogenität ist nicht überraschend, da viele Faktoren wie geografische Lage, Wetterbedingungen, Populationsgenetik, Ernährungsgewohnheiten und Grünflächen einen starken Einfluss auf die Zusammensetzung des Darmmikrobioms haben. Um die Rolle des Mikrobioms bei Brustkrebs besser zu verstehen, benötigen wir daher Daten aus mehreren geografischen Regionen. Daher wurde diese Studie durchgeführt, um festzustellen, ob bei Brustkrebspatientinnen aus der Region Mittlerer Westen der USA eine Darmdysbiose vorliegt.

Wir haben Patientinnen mit Brustkrebs (BC) über die Breast Molecular Epidemiology Resource (BMER) des Holden Comprehensive Cancer Center (HCCC) und gesunde Kontrollpersonen (HC) an der University of Iowa rekrutiert. In dieser Pilotstudie berichten wir über einen signifikanten Unterschied in der mikrobiellen Zusammensetzung des Darms bei BC im Vergleich zu HC, deren Rasse, Body-Mass-Index (BMI) und Geschlecht übereinstimmen.

Um das Darmmikrobiom der Kohorten BC (n = 24) und HC (n = 23) zu beobachten, wurde eine metagenomische Sequenzierung der V3-V4-Region der 16S-rRNA verwendet. Nachdem wir Probanden mit Sequenzen geringer Qualität und einen präkanzerösen Patienten entfernt hatten, hatten wir 22 BC-Patienten und 19 HC-Patienten zur weiteren Analyse. Zunächst wurde das Verhältnis zwischen Firmicutes/Bacteroidetes beobachtet, da es als Marker für Dysbiose gilt21. Dieser Vergleich wurde vor dem Filtern oder Normalisieren der Merkmalshäufigkeiten durchgeführt, um die Rohwertunterschiede zu beobachten. Dieses Verhältnis unterschied sich zwischen den beiden Kohorten nicht signifikant (p-Wert: 0,06241) (Abb. 1A). Als nächstes wurden die Unterschiede zwischen den Gruppen auf Gattungs- und Artenebene analysiert.

Die Zusammensetzung des Darmmikrobioms unterscheidet sich zwischen Patientinnen mit Brustkrebs und gesunden Kontrollpersonen. (a) Das Firmicutes/Bacteroidetes-Verhältnis bei Patienten mit BC und HC. Die Verhältnisse unterscheiden sich nicht signifikant (p = 0,06241). (b) Der Chao1-Index wurde zur Messung des Gattungsreichtums verwendet. Dieser Vergleich unterschied sich zwischen BC und HC nicht signifikant (p = .111). (c) Diese Messung wurde auch zur Analyse des Artenniveaus verwendet. Es gab keinen signifikanten Unterschied zwischen den beiden Gruppen auf Artenebene (p = 0,129). (d) Die gewichtete UniFrac-Distanzmetrik wurde verwendet, um die Beta-Diversität auf Gattungsebene zu analysieren und BC und HC signifikant zu gruppieren (p = 0,011). (e) Diese Metrik wurde auch zur Analyse des Artenniveaus verwendet, und BC und HC gruppierten sich erneut signifikant (p = 0,014).

Insgesamt wurden 519 Arten und 340 Gattungen identifiziert. Von diesen 519 Arten wurden 61 ausschließlich bei HC-Patienten und 81 ausschließlich bei BC-Patienten gefunden. Von diesen 340 Gattungen kamen 28 nur bei HC und 49 nur bei BC-Patienten vor. Nach der Filterung blieben 114 Arten und 92 Gattungen übrig. Die Alpha-Diversität der vornormierten Daten wurde mit dem Chao1-Index gemessen; Es war jedoch auf Artenebene (p = 0,129) oder Gattungsebene (p = 0,111) zwischen BC- und HC-Kohorten nicht signifikant (Abb. 1B und C). Die Shannon-Diversität unterschied sich auch nicht signifikant zwischen BC und HC auf Arten- oder Gattungsebene (p = 0,344 bzw. p = 0,414). Die Beta-Diversität wurde mithilfe der gewichteten UniFrac-Distanzmetrik gemessen, die die Mikrobiome jeder Probe vergleicht, indem sie die Menge der vorhandenen Merkmale bewertet und gleichzeitig die phylogenetischen Beziehungen zwischen diesen Merkmalen berücksichtigt. Die Beta-Diversität war auf der Ebene der Arten (p = 0,014) und der Gattung (p = 0,011) statistisch signifikant, was auch an der deutlichen Häufung von BC und HC in getrennten Gruppen auf beiden Ebenen erkennbar ist (Abb. 1D und E).

Für einen Überblick über das fäkale Mikrobiom wurde ein Wärmebaum verwendet. Dies bietet eine visuelle Darstellung der Bakterienmerkmale, die zwischen den Gruppen angereichert oder reduziert/abgereichert sind (Abb. 2). Für eine Gesamtübersicht der am häufigsten vorkommenden Gattungen, Familien und Stämme haben wir in der ergänzenden Abbildung 1 ein gestapeltes Balkendiagramm für jede dieser Taxa-Ebenen eingefügt. Ein genauerer Blick auf diese Merkmale ergab 16 Arten, die sich zwischen BC und HC signifikant unterschieden basierend auf ihrer normalisierten Log-Häufigkeit mit dem Wilcoxon-Signed-Rank-Sum-Test. Signifikante Merkmale hatten einen ap-Wert ≤ 0,05 und einen angepassten p-Wert ≤ 0,15. Zu den bemerkenswerten Arten, die in der BC-Kohorte häufiger vorkommen als in der HC-Kohorte, gehören Oscillospiraceae-Arten, Actinomyces-Arten, Eggerthella lenta, Faecalitalea-Arten, Intestinibacter bartlettii und Blautia-Arten (Abb. 3A – F). Zu den Arten, die in der BC-Kohorte im Vergleich zur HC-Kohorte eine geringere Häufigkeit aufweisen, gehören Faecalibacterium prausnitzii, Erysipelotrichaceae UCG 003-Bakterium, Alistipes-Arten, Oscillibacter-Arten, Lachnospiraceae UCG 010-Arten, Lachnoclostridium edouardi, Lachnospira pectinoshiza und Parabacteroides merdae (Abb. 4A–H). . Eine vollständige Zusammenfassung dieser Ergebnisse finden Sie in der Ergänzungstabelle 1.

Unterschiede in der phylogenetischen Diversität zwischen Patientinnen mit Brustkrebs und gesunden Kontrollpersonen. Dieser Wärmebaum repräsentiert die phylogenetischen Unterschiede zwischen HC und BC. Rot zeigt eine höhere Häufigkeit in BC im Vergleich zu HC an und Blau zeigt eine geringere Häufigkeit in BC als in HC an. Dieser Wärmebaum wurde mit der webbasierten Schnittstelle MicrobiomeAnalyst mit Aktualisierungen ab Frühjahr 202278,79 erstellt.

Bei Patientinnen mit Brustkrebs kam es im Vergleich zu gesunden Kontrollpersonen deutlich zu einem Anstieg der Bakterienzahl. (a–f) Basierend auf dem Wilcoxon-Test und dem Benjamini-Hochberg-Verfahren waren 6 Merkmale in der Brustkrebskohorte im Vergleich zu den gesunden Kontrollpersonen signifikant häufiger anzutreffen (p ≤ 0,05, q ≤ 0,15). Bedeutung: * < 0,05 und ** < 0,01.

Bei Brustkrebspatientinnen kam es im Vergleich zu gesunden Kontrollpersonen zu einer signifikanten Abnahme der Bakterienzahl. (a–h) Basierend auf dem Wilcoxon-Test und dem Benjamini-Hochberg-Verfahren waren 8 Merkmale in der Brustkrebskohorte im Vergleich zu den gesunden Kontrollpersonen deutlich seltener (p ≤ 0,05, q ≤ 0,15). Bedeutung: * < 0,05, ** < 0,01 und *** < 0,001.

Zuletzt haben wir eine lineare Diskriminanzanalyse-Effektgröße (LEfSe) durchgeführt, die Merkmale identifiziert, die die beiden Gruppen unterscheiden, indem statistische Tests mit biologischer Konsistenz und Signifikanz kombiniert werden22. Mithilfe von LEfSe beobachteten wir fünf Merkmale mit einem LDA-Wert von mindestens drei in HC und 15 Merkmale mit einem LDA-Wert von mindestens drei in BC. Alle durch LEfSe identifizierten Arten wurden auch im univariaten Test mit der gleichen Beziehung zwischen HC und BC identifiziert (Abb. 5).

Unterscheidung der Taxa zwischen Patientinnen mit Brustkrebs und gesunden Kontrollpersonen. Die 20 wichtigsten Merkmale, ausgewählt durch die LEfSe-Analyse. Der LDA-Score gibt die Effektgröße jedes Merkmals an.

Der Random-Forest-Algorithmus für maschinelles Lernen wurde angewendet, um die Fähigkeit des fäkalen Mikrobioms zu bewerten, den BC-Phänotyp vorherzusagen. Konkret wurde ein Bootstrapping-Zufallswald mit 500 Bäumen verwendet, um ein Vorhersagemodell basierend auf BC- und HC-Proben zu erstellen. Die 15 wichtigsten Merkmale, die für die Identifizierung der Kohorte, aus der die Probe stammt, wichtig sind, sind in Abb. 6 dargestellt. Anschließend verwendeten wir die Boruta23-Funktion in R mit einem Signifikanzniveau von 0,01, um die Bakterienarten zu identifizieren, die für die Unterscheidung zwischen BC- und HC-Proben wichtig sind. Neun dieser 15 Merkmale waren signifikant, wie in Grün dargestellt. Sieben dieser neun signifikanten Arten wurden in unserer univariaten Analyse auch als signifikant unterschiedlich identifiziert. Zu den Arten, die in der univariaten Analyse in BC im Vergleich zu HC seltener vorkommen und auch in der Zufallswaldanalyse als signifikant angesehen wurden, gehören Faecalibacterium prausnitzii, Parabacteroides merdae und Oscillibacter-Arten. Zu den Arten, die in der univariaten Analyse häufiger in BC im Vergleich zu HC auftraten und die auch in der Zufallswaldanalyse als signifikant angesehen wurden, gehören Intestinibacter bartelli, Actinomyces-Arten, Faecalitalea-Arten und Oscillospiraceae-Arten. Zwei Arten erwiesen sich auf der Grundlage der zufälligen Waldanalyse als signifikant, jedoch nicht im univariaten Test: Bifidobacterium longum und Lachnospiraceae NK4A136-Gruppenarten.

Random Forest identifiziert Schlüsselarten für die Unterscheidung zwischen dem Mikrobiom von Patientinnen mit Brustkrebs und gesunden Kontrollpersonen. Der Random-Forest-Algorithmus für maschinelles Lernen wurde verwendet, um zu sehen, ob das fäkale Mikrobiom zwischen BC und HC unterscheiden kann. Wir haben einen Bootstrapping-Random-Forest-Algorithmus mit 500 Bäumen verwendet. Die Signifikanz basierte auf dem Boruta-Algorithmus mit einem grün hervorgehobenen Signifikanzniveau von 0,01.

Um das Funktionsprofil des Mikrobioms (Metagenoms) unserer Proben abzuschätzen, wurde PICRUSt2 (Phylogenetic Investigation of Communities by Reconstruction of Unobserved States) verwendet24. Dieses Bioinformatik-Tool analysierte das Metagenom der Bakterien in unseren Stuhlproben mithilfe der 16S-rRNA-Sequenzen. Kurz gesagt: PICRUSt2 schätzt die Häufigkeit der Genfamilien in der Probe, um die Zusammensetzung des Metagenoms zu bestimmen. Durch diese Analyse wurden 43 statistisch signifikante Pfade identifiziert (Ergänzungstabelle 2). Zwei dieser Wege sind am Stoffwechsel kurzkettiger Fettsäuren (SCFA) beteiligt: Pyruvat-Fermentation zu Propanoat und Methanogenese aus Acetat (Abb. 7A und B). Daher legt unser markerbasiertes Funktionsprofil nahe, dass BC im Vergleich zu HC über unterschiedliche Funktionswege verfügt, wobei die Häufigkeit der an der Produktion von SCFA beteiligten Wege geringer ist.

Das Funktionsprofil des Darmmikrobioms unterscheidet sich zwischen Patientinnen mit Brustkrebs und gesunden Kontrollpersonen. Basierend auf dem Wilcoxon-Test und dem Benjamini-Hochberg-Verfahren unterschieden sich 43 Signalwege signifikant zwischen BC und HC. Zwei Wege wurden hervorgehoben, da sie am Stoffwechsel kurzkettiger Fettsäuren beteiligt sind: (a) Pyruvat-Fermentation zu Propanoat und (b) Methanogenese aus Acetat. Bedeutung: * < 0,05 und ** < 0,01.

Das Darmmikrobiom hat sich als potenzieller Faktor in der Pathobiologie von Brustkrebs herausgestellt. Da die geografische Region und die Umgebung eine wichtige Rolle bei der Gestaltung des individuellen Mikrobioms spielen, ist eine neue regionalspezifische Studie erforderlich, um das fäkale Mikrobiom bei Brustkrebspatientinnen zu profilieren. Diese Studie ist die erste, die das Darmmikrobiom von Brustkrebspatientinnen und gesunden Kontrollpersonen aus der Region des Mittleren Westens der Vereinigten Staaten auf taxonomische Zusammensetzung und prädiktive Funktionsprofile analysiert. Unsere Ergebnisse zeigen ein verändertes Darmmikrobiom mit reduzierten SCFA-produzierenden Darmbakterien bei BC-Patienten.

Unsere Daten, die eine Darmdysbiose bei BC zeigen, stimmen mit früheren Studien überein und legen nahe, dass das Darmmikrobiom eine Rolle bei Brustkrebs spielt3,5,10. Von den acht Arten, die in unserer BC-Kohorte eine verringerte Häufigkeit aufweisen, produzieren sechs entweder SCFAs (d. h. F. prausnitzii, L. pectinoshiza und P. merdae) oder sind Mitglieder von SCFA-produzierenden Gattungen (d. h. Lachnoclostridium, Alistipes und Oscillibacter). . F. prausnitzii macht 5 % der menschlichen Fäkalienbakterien aus25,26 und ist eine der wichtigsten Butyrat (C4) produzierenden Arten im Darm27,28,29. L. pectinoschiza, das Polygalacturonsäure zu Formiat (C1) und Acetat (C2)30 fermentiert, zeigte in der BC-Kohorte ebenfalls eine verringerte Häufigkeit. Schließlich wurde P. merdae, das Acetat (C2)31 produziert, in der BC-Kohorte reduziert.

Lachnoclostridium, Alistipes und Oscillibacter sind allesamt Gattungen, die mit der SCFA-Produktion assoziiert sind. Lachnoclostridium symbiosum produziert Butyrat (C4)32, Alistipes produziert geringe Mengen Acetat (C2), Valerat (C5), Propionat (C3) und Butyrat (C4)33 und Oscillibacter valericigenes und Oscillibacter ruminantium produzieren Valerat (C5)34 und Butyrat (C4)35 bzw. Die in unserer BC-Kohorte reduzierten Alistipes- und Oscillibacter-Arten wurden nicht klassifiziert, obwohl sie aufgrund der Eigenschaften phylogenetisch ähnlicher Arten potenziell SCFA-produzierende Arten sind. L. edouardi ist phylogenetisch mit L. symbiosum verwandt (mit einer 16S-rRNA-Gensequenzidentität von 94,26 %36), was auf die Reduzierung eines zusätzlichen SCFA-Produzenten in unserer BC-Kohorte schließen lässt.

Im Dickdarm sind SCFAs die primären bakteriellen Fermentationsmetaboliten unverdaulicher Kohlenhydrate. Im menschlichen Darmmikrobiom sind SCFAs überwiegend Acetat (C2), Propionat (C3) und Butyrat (C4)37, umfassen aber auch Formiat (C1) und Valerat (C5). Eine Veränderung der SCFAs kann mit verschiedenen entzündlichen Erkrankungen verbunden sein (z. B. Multiple Sklerose, entzündliche Darmerkrankungen und Fettleibigkeit)38,39,40. Darüber hinaus gibt es Hinweise darauf, dass SCFAs für die Homöostase wichtig sind, indem sie die Integrität des Dickdarmepithels, die Adipozytenlipolyse und die Regulierung des Immunsystems modulieren41. Viele der Wirkungen von SCFAs werden wahrscheinlich durch die G-Protein-gekoppelten Rezeptoren GPR43 und GPR4142 vermittelt. Speziell für Brustkrebs aktivieren SCFAs GPR41- und GPR43-vermittelte Signalwege in der menschlichen Brustkrebszelllinie MCF-743, und diese Rezeptoren haben im Vergleich zu gesundem Brustgewebe eine verringerte Expression bei invasivem Brustkarzinom und aggressiven dreifach negativen Brusttumoren gezeigt44.

Im Gegensatz dazu waren zwei mit der SCFA-Produktion assoziierte Arten in der BC-Kohorte signifikant angereichert (Intestinibacter bartletti- und Faecalitalea-Arten). I. bartletti produziert Acetat (C2), Valerat (C5) und Butyrat (C4)45 und Faecalitalea produziert Butyrat (C4)46. Die nicht klassifizierte Art von Faecalitalea, die in unserer BC-Kohorte angereichert wurde, ist eine potenziell SCFA-produzierende Art. Es ist möglich, dass diese SCFA-produzierenden Bakterien auf Bakterien angewiesen sind, die in der BC-Kohorte angereichert sind, und/oder dass von ihnen produzierte SCFA-Metaboliten in Entzündungswege einfließen. Insgesamt sind in unserer BC-Kohorte mehr SCFA-produzierende Bakterien deutlich abgereichert als angereichert. Diese Ergebnisse legen nahe, dass eine Dysbiose von SCFA-produzierenden Bakterien in unserer BC-Kohorte einen Einfluss auf die Pathobiologie von Brustkrebs haben könnte.

Wir haben 43 signifikante, unterschiedlich häufig vorkommende Funktionswege identifiziert. Interessanterweise war der Pyruvat-Fermentation-zu-Propanoat-I-Weg in der BC-Kohorte signifikant verringert und der Methanogenese-aus-Acetat-Weg in der BC-Kohorte signifikant erhöht. Diese Veränderungen führen zu einer Verringerung der SCFAs und einem Anstieg des Methans im Darm. Frühere Studien haben einen Anstieg des Methans im Darm mit entzündlichen Erkrankungen wie Multipler Sklerose und Reizdarmsyndrom in Verbindung gebracht47,48. Mikrobielle SCFAs im Darm steigern die Serotoninproduktion im Dickdarm und fördern so die Magen-Darm-Motilität49. Eine Verringerung der SCFAs würde daher die Darmmotilität verringern, und ein erhöhter Methangehalt im Darm verlangsamt auch die Darmpassage50,51. Es wird angenommen, dass diese verminderte Darmpassage die Nährstoffaufnahme erhöht, was zu Gewichtszunahme und Fettleibigkeit führt52. Fettleibigkeit trägt zu systemischen Entzündungen bei53 und erhöht das Risiko, an Brustkrebs bei Frauen nach der Menopause zu erkranken54,55. Daher kann eine verringerte Häufigkeit von SCFA-produzierenden Bakterien durch die Auslösung einer Entzündung durch Modulation von Serotonin zu Brustkrebs beitragen.

Zusätzlich zu den SCFA-produzierenden Bakterien waren Eggerthella lenta und eine Art der Gattung Blautia bei BC-Patienten im Vergleich zu HC signifikant angereichert. Die Anreicherung von E. lenta ist mit verschiedenen Entzündungszuständen verbunden, darunter Kolitis56 und Multiple Sklerose57. Die Rolle von Blautia bei Krankheiten ist umstrittener, da sowohl die Verarmung als auch die Anreicherung dieser Gattung mit entzündlichen Zuständen in Verbindung gebracht wurde (z. B. Verarmung von Blautia bei Patienten mit Morbus Crohn58, Darmkrebs59 und Multipler Sklerose60; Anreicherung von Blautia bei Patienten mit Multipler Sklerose Sklerose48 und entzündliches Darmsyndrom61).

In dieser Studie wollten wir die regionalspezifische mikrobielle Zusammensetzung von Brustkrebspatientinnen im Mittleren Westen der USA ermitteln. Es ist allgemein bekannt, dass die geografische Lage das Darmmikrobiom beeinflussen kann, wie eine Studie zeigt, die eine unterschiedliche Mikrobiomzusammensetzung bei Personen aus den Vereinigten Staaten im Vergleich zu anderen Ländern zeigt62. Im Vergleich zu unserer Studie haben Yatsunenko et al. stellten fest, dass Erwachsene aus Ballungsräumen der Vereinigten Staaten im Vergleich zu Erwachsenen aus Malawi und Venezuela eine größere Häufigkeit einer nicht identifizierten Alistipes-Art aufweisen62. In dieser Studie haben wir eine verringerte Häufigkeit einer nicht identifizierten Alistipes-Art in unserer BC-Kohorte festgestellt. Aufgrund der erhöhten Häufigkeit einer nicht identifizierten Alistipes-Art bei gesunden Erwachsenen aus den Vereinigten Staaten könnte es sich hierbei um eine US-spezifische Dysbiose handeln.

Nur wenige Studien haben die intrakontinentalregionspezifischen Unterschiede der Darmmikrobenzusammensetzung auf Gattungs- oder Artenebene untersucht. Zuvor haben Chen et al. analysierten die mikrobielle Zusammensetzung des Darms von 118 Probanden aus dem Mittleren Westen, die sich nach Geschlecht, Rasse, BMI, Alter, Alkoholkonsum und Tabakkonsum unterschieden, um eine Referenzpopulation für den Mittleren Westen für die Darmmikrobiomforschung zu erstellen63. Sie fanden für unsere Studie relevant, dass die Gattungen Faecalibacterium, Parabacteroides, Lachnospira und Blautia zu den am weitesten verbreiteten Gattungen in dieser gesunden Population des Mittleren Westens gehörten63. In unserer Studie haben wir festgestellt, dass Patienten im Mittleren Westen von British Columbia eine deutlich unterschiedliche Artenhäufigkeit innerhalb dieser Gattungen aufwiesen. Insbesondere zeigte unsere BC-Kohorte eine verringerte Häufigkeit von Faecalibacterium prausnitzii, Parabacteroides merdae und Lachnospira pectinoschiza sowie eine erhöhte Häufigkeit einer nicht identifizierten Blautia-Art. Wichtig ist, dass diese regionalspezifische Referenzpopulation keinen signifikanten Unterschied in der Alpha- oder Beta-Diversität basierend auf dem Alter aufwies63, was darauf hindeutet, dass das Erwachsenenalter möglicherweise eine geringere Rolle für die mikrobielle Diversität in der Region des Mittleren Westens der Vereinigten Staaten spielt.

Zusammenfassend zeigte diese Pilotstudie in unserer BC-Kohorte eine Dysbiose mit verringerter Häufigkeit von SCFA-produzierenden Bakterien, verringerter Produktion von Propionat und erhöhter Umwandlung von Acetat in Methan. Unsere Ergebnisse stützen die Hypothese, dass eine verringerte Häufigkeit von SCFA-produzierenden Fäkalienbakterien zur Pathobiologie von Brustkrebs beitragen kann64. Aufgrund technischer Schwierigkeiten, einschließlich der Probenlagerung, konnten wir den SCFA im Stuhl nicht messen. Eine frühere Studie hat gezeigt, dass SCFAs bei Kontakt mit der Atmosphäre aus dem Stuhl verdunsten. Daher müssen die Proben bei der Messung des SCFA-Gehalts sofort ordnungsgemäß gelagert werden65. Zukünftige Studien sollten die Häufigkeit von SCFAs in Stuhlproben von Brustkrebspatientinnen messen, um diese Ergebnisse zu bestätigen, wie dies bereits in ähnlichen Studien getan wurde15. Ein besseres Verständnis der Rolle der Darmdysbiose bei Brustkrebs könnte zu einer verfeinerten Prävention, Behandlung und Prognose führen.

Zu den Einschränkungen dieser Studie gehören eine kleine Stichprobengröße, fehlende Informationen zum Menopausenstatus der gesunden Kontrollpersonen, ein signifikanter Unterschied im Kohortenalter und die möglichen Auswirkungen verschiedener Behandlungen auf das Mikrobiom. Aufgrund der geringen Stichprobengröße konnten wir keine Schichtung nach Brustkrebs-Subtypen durchführen. Zukünftige Studien sollten jedoch darauf abzielen, Kohorten zu rekrutieren, die groß genug sind, um diese Analyse zu ermöglichen.

Unsere BC-Kohorte war deutlich älter als unsere HC-Kohorte. Obwohl das Alter auch eine Rolle bei den Unterschieden in der mikrobiellen Zusammensetzung des Darms zwischen unseren beiden Kohorten spielen könnte, sind sich die Studien über die Rolle des Alters in der mikrobiellen Zusammensetzung nach dem mittleren Alter widersprüchlich. Ghosh et al. untersuchte eine Kohorte von 2500 Personen und stellte fest, dass ältere Personen im Vergleich zu jungen Erwachsenen oder mittel- Erwachsene im Alter66. Im Gegensatz dazu haben de la Cuesta-Zuluaga et al. zeigten, dass die mikrobielle Vielfalt gesunder Frauen in Kohorten aus den Vereinigten Staaten, dem Vereinigten Königreich und Kolumbien mit zunehmendem Alter zunimmt und bei etwa 40 Jahren ein Plateau erreicht67. In derselben Studie zeigte eine Kohorte aus China keinen Einfluss auf die mikrobielle Vielfalt, wenn sie nach Alter geschichtet wurde67. Diese Studien deuten darauf hin, dass das Alter nach dem 40. Lebensjahr möglicherweise eine Rolle in der Mikrobiota einiger Krankheitszustände spielt, in der Mikrobiota gesunder Kontrollpersonen jedoch keine signifikante Rolle zu spielen scheint. Weitere Forschung in diesem Bereich ist erforderlich, um das Zusammenspiel von Alter, Krankheit und Mikrobiom besser zu verstehen.

Wir sind uns bewusst, dass Chemotherapie und Bestrahlung das Mikrobiom beeinflussen. In dieser Studie endete die Chemotherapie bei allen BC-Patienten mindestens 145 Tage vor der Probenentnahme. Derzeit ist nicht bekannt, ob eine Chemotherapie dauerhafte Auswirkungen auf das Mikrobiom hat. Die Strahlentherapie endete mindestens 31 Tage vor der Probenentnahme und zielte auf Tumore in der Brust ab, wodurch das Darmmikrobiom geschont worden wäre. Darüber hinaus haben wir das Mikrobiom von BC unter Chemotherapie (n = 4) vs. keiner Chemotherapie (n = 18) und BC unter Strahlentherapie (n = 9) vs. keiner Strahlentherapie (n = 13) vor unserer BC- vs. HC-Analyse verglichen fanden heraus, dass sich die Alpha- und Beta-Diversität zwischen diesen Therapien innerhalb der BC-Kohorte weder signifikant unterschied, noch wurden Arten oder Gattungen identifiziert, die sich signifikant unterschieden. Unsere vorläufige Untersuchung ergab daher, dass, wenn Chemotherapie oder Bestrahlung Auswirkungen auf das Darmmikrobiom hatten, diese Veränderungen zum Zeitpunkt dieser Analyse abgeklungen waren und BC-Proben daher im Vergleich zu HC-Proben nicht weiter auf der Grundlage dieser Therapien aufgeteilt werden mussten.

Wir erkennen auch an, dass eine Hormontherapie Auswirkungen auf das Mikrobiom haben kann. Die Hormontherapien, die unsere BC-Patienten in dieser Studie erhielten, waren selektive Östrogenrezeptormodulatoren (SERMs; z. B. Nolvadex) und Aromatasehemmer (z. B. Arimidex, Aromasin und Femara). Das Darmmikrobiom reguliert den zirkulierenden Östrogenspiegel68 und SERMs sind für bestimmte Darmbakterienarten toxisch10. Unseres Wissens nach wurden die Bakterien, die sich in unserer Studie als signifikant herausstellten, nicht durch SERMs beeinträchtigt. Allerdings sind die spezifischen Wirkungen von Aromatasehemmern auf das Darmmikrobiom nicht gut belegt10. Zukünftige Studien sollten diese Mängel beheben, um unser Verständnis des Zusammenhangs des Darmmikrobioms mit Brustkrebs zu stärken.

Diese Studie wurde vom Institutional Review Board der University of Iowa (Iowa City, IA, USA) genehmigt. Patienten mit BC (n = 24) wurden vom BMER am HCCC rekrutiert. Einschlusskriterien waren die Diagnose eines invasiven Brustkrebses in jedem Stadium und Alter zwischen 18 und 90 Jahren. Ausschlusskriterien waren der Einsatz von Antibiotika während der Probenentnahme und eine prämaligne oder in situ auftretende Brusterkrankung ohne gleichzeitigen invasiven Krebs. Für BC-Patienten wurden Daten zu Body-Mass-Index (BMI), Rasse, Alter, Lymphknotenstatus, Menopausenstatus, Art und Datum der erhaltenen Behandlungen sowie Krebsstadium gesammelt. Bei allen BC-Patienten war die Chemotherapie 145 Tage oder länger vor der Probenentnahme beendet worden, und die letzte Bestrahlungsbehandlung erfolgte 31 Tage oder mehr vor der Probenentnahme. Von den BC-Patienten befanden sich 22 zum Zeitpunkt der Probenentnahme in Hormontherapie.

HC (n = 23) wurden über das University of Iowa College of Nursing rekrutiert. Einschlusskriterien waren Frauen im Alter von 18–90 Jahren. Ausschlusskriterien waren die Einnahme von Antibiotika oder Abführmitteln innerhalb von vier Wochen nach der Probenentnahme und die Koloskopie innerhalb von drei Monaten. Für gesunde Kontrollpersonen wurden Daten zu BMI, Rasse und Alter erhoben.

Ein BC-Patient und vier HC-Patienten wurden aufgrund schlechter Sequenzqualität von der Analyse ausgeschlossen, und ein BC-Patient wurde aufgrund einer prämalignen Läsion ausgeschlossen. Dies führte zu 22 BC-Patienten und 19 HC-Patienten. Die Merkmale des Probanden sind in Tabelle 1 beschrieben.

Stuhlproben wurden von Patienten in von unserem Labor bereitgestellten Commode Specimen Collection Kits (Fisher PA, USA) gesammelt. Stuhlproben wurden auf Eis versandt und innerhalb von 24 Stunden nach der Entnahme empfangen. Der Stuhl wurde aliquotiert und innerhalb von 24 Stunden nach Erhalt bei –80 °C gelagert. Für die fäkale DNA-Extraktion aus den Proben verwendeten wir das Qiagen DNeasy PowerLyser PowerSoil Kit (Qiagen, Germantown, MD). Wir folgten den Anweisungen des Herstellers und führten den Schritt des Perlenschlagens durch (PowerLyzer 24 Homogenizer, Omni International, USA). Die Sequenzierung der V3-V4-Region der 16S-rRNA wurde wie zuvor von unserem Labor beschrieben69 durchgeführt.

Wir haben die Rohsequenzdaten von Stuhlproben unter Verwendung der V3-V4-Region der bakteriellen 16S-rRNA und der DADA2-Pipeline70 verarbeitet. Kurz gesagt, wir haben die Primer entfernt, den Rest der Sequenz basierend auf einem Phred-Qualitätswert von 25 gekürzt und dann die Lesevorgänge entrauscht. Rauschunterdrückung wurde verwendet, um ungenaue Basisaufrufe zu verhindern. Als nächstes wurden gepaarte Lesevorgänge zusammengeführt und Chimären entfernt. Die verbleibenden Sequenzen erzeugten unsere Amplikonsequenzvarianten (ASVs). Um diesen ASVs eine Taxonomie zuzuweisen, wurde die Silva-Datenbank verwendet (Version 138.1, veröffentlicht im März 2021)71. Nach der Zuordnung der Taxonomie wurden eine BC-Probe und vier HC-Proben aufgrund einer geringen Lesetiefe (d. h. weniger als 27.000 Lesevorgänge) entfernt, was zu 22 BC-Patienten und 19 HC-Patienten führte. Die übrigen Proben hatten 27.000 bis 86.874 Zählungen, was einem Durchschnitt von 64.265 Zählungen pro Probe entspricht.

Um die möglichen Funktionen des Mikrobioms zu identifizieren, verwendeten wir Tools von DADA2, die unsere bereinigten Sequenzdaten in eine ASV-Tabelle mit einer entsprechenden FASTA-Sequenzdatei konvertierten. Anschließend haben wir mithilfe von PICRUSt224 mögliche Funktionswege vorhergesagt.

Für Analysen und Abbildungserstellung verwendeten wir R (Version 4.0.3)72. Die Alpha-Diversitäts-, Beta-Diversitäts- und Differentialhäufigkeitsanalysen der vorliegenden Merkmale wurden mit internen Skripten durchgeführt, die Phyloseq73, MicrobiomeMarker74, Vegan75 und ggpubr76 verwendeten. Die Daten wurden durch Summenskalierung auf eine Million Lesevorgänge auf Probenebene und Log-Transformation (Basis 10) auf Bakterienebene normalisiert. Merkmale mit einer Prävalenz von weniger als 20 und einer relativen Häufigkeit von weniger als 1e-4 wurden ebenfalls herausgefiltert. Diese Grenzwerte wurden gewählt, um ungenaue Aussagen über die Bedeutung aufgrund des Fehlens des Merkmals in einer Gruppe und einer geringen Präsenz in der anderen Gruppe auszuschließen. Insgesamt wurden 519 Arten und 340 Gattungen identifiziert. Nach der Filterung blieben 114 Arten und 92 Gattungen übrig. Für unsere Pfadanalyse wurden Pfade mit einem relativen Häufigkeitsschwellenwert von weniger als 0,0001 (prozentuale Zusammensetzung) herausgefiltert. Die Alpha-Diversität wurde mithilfe des Chao1-Index und der Shannon-Diversität gemessen. Für die Differentialhäufigkeitsanalysen wurde die Signifikanz mit dem Wilcoxon-Signed-Rank-Test gemessen und angepasste p-Werte wurden mit dem Benjamini-Hochberg-Algorithmus berechnet. Für die Beta-Diversität wurde die gewichtete UniFrac-Distanzmetrik verwendet und die Bedeutung der Probenclusterung wurde durch PERMANOVA identifiziert. LEFSe wurde mit der Funktion run_lefse aus dem microbiomeMarker R-Paket durchgeführt. Random Forest wurde mit den Funktionen randomForest77 und Boruta23 in R durchgeführt. Weitere Details zur Random Forest-Analyse finden Sie im Abschnitt „Random Forest identifiziert Schlüsselarten bei der Unterscheidung zwischen dem Mikrobiom von Patientinnen mit Brustkrebs und gesunden Kontrollpersonen“. LEFSe ist eine häufig verwendete Differentialanalysemethode, während Random Forest ein auf maschinellem Lernen basierender Ansatz ist. LEFSe identifiziert die Taxa, deren Häufigkeit in einer Gruppe im Vergleich zur anderen deutlich erhöht ist, und berechnet gleichzeitig die Effektgröße jedes Merkmals. Random Forest hingegen nutzt viele Entscheidungsbäume und Bagging (Mehrheitsabstimmung der Entscheidungsbäume), um zu entscheiden, welche Merkmale bei der Differenzierung der Gruppen am meisten helfen. Wenn wir also beide sehr unterschiedlichen Ansätze anwenden und in beiden die gleichen Merkmale finden, können wir mehr Vertrauen in die als signifikant identifizierten Merkmale haben.

Der Wärmebaum wurde in MicrobiomeAnalyst78,79 erstellt. Die minimale Merkmalsanzahl wurde auf 20 festgelegt, die prozentuale Prävalenz in jeder Stichprobe wurde auf 20 festgelegt und 10 % der Merkmale wurden basierend auf ihrem Interquartilbereich entfernt. Die Gesamtsummenskalierung wurde verwendet, um die Merkmalsdaten zu normalisieren und den Wärmebaum zu erstellen.

Diese Studie wurde in Übereinstimmung mit den ethischen Standards durchgeführt, die in der Helsinki-Erklärung von 1964 und ihren späteren Änderungen oder vergleichbaren ethischen Standards festgelegt sind. Forschungsproben und/oder klinische Daten wurden über die „Breast Molecular Epidemiology Resource“ (BMER) des Holden Comprehensive Cancer Center der University of Iowa erhalten, ein vom Institutional Review Board genehmigtes Bioproben-Repository und Datenregister (IRB 201003791).

Die Einverständniserklärung aller in die Studie einbezogenen Einzelteilnehmer wurde eingeholt.

Die 16S-Mikrobiomdaten wurden zum kostenlosen öffentlichen Zugriff unter der BioProject-ID: PRJNA872152 in das Sequence Read Archive (SRA) hochgeladen. Die restlichen Daten können durch Kontaktaufnahme mit dem jeweiligen Autor zur Verfügung gestellt werden.

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Die in dieser Veröffentlichung berichtete Forschung wurde durch das Patients Enhancing Research Collaboration at Holden Program (IRB 201708847) unterstützt, das vom Biospecimen Procurement and Molecular Epidemiology Resource Core (BioMER) am Holden Comprehensive Cancer Center, National Cancer Institute/Nation Institute of Health unter der Award-Nummer unterstützt wird P30CA086862. Wir bedanken uns für die Finanzierung durch die National Institutes of Health/NIAID 1RO1AI137075 (AKM), den Veteran Affairs Merit Award 1I01CX002212 (AKM), das University of Iowa Environmental Health Sciences Research Center, NIEHS/NIH P30 ES005605 (AKM), ein Geschenk von P. Heppelmann und M . Wacek (AKM), Carver Trust Pilot Grant (AKM) und Pilotpreis vom Center for Biocatalysis and Bioprocessing (CBB) (AKM), RLS wurde durch das Informatics Fellowship der University of Iowa unterstützt. JEK wurde durch ein Stipendium der National Institutes of Health (T32 GM139776 für das Medical Scientist Training Program der University of Iowa) unterstützt.

Diese Autoren haben gleichermaßen beigetragen: Rachel L. Shrode, Jessica E. Knobbe und Nicole Cady.

Fakultät für Informatik, University of Iowa, Iowa City, IA, 52242, USA

Rachel L. Shrode & Ashutosh K. Mangalam

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Jessica E. Knobbe & Ashutosh K. Mangalam

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Jessica E. Knobbe

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Jessica E. Knobbe

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Nicole Cady, Meeta Yadav und Ashutosh K. Mangalam

Abteilung für Mikrobiologie und Immunologie, University of Michigan, Ann Arbor, MI, 48109, USA

Nicole Cady

College of Dentistry, University of Iowa, Iowa City, IA, 52242, USA

Meeta Yadav & Ashutosh K. Mangalam

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Jemmie Hoang und Catherine Cherwin

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Melissa Curry

Abteilung für Innere Medizin, University of Iowa, Iowa City, IA, 52242, USA

Rohan Garje & Praveen Vikas

Abteilung für Chirurgie, University of Iowa, Iowa City, IA, 52242, USA

Sonia Sugg

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Cytonus Therapeutics, Carlsbad, CA, USA

Edward Filardo

University of Iowa, 25 S Grand Ave, 1080-ML, Iowa City, IA, 52246, USA

Ashutosh K. Mangalam

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AKM, MY, CC, MC, PV., SS, SP, EF und RG trugen zur Konzeption und Gestaltung der Studie bei. Die Materialvorbereitung und Datenerfassung wurden von NC, MY und JH durchgeführt. Die Datenanalyse wurde von RLS durchgeführt. Das Manuskript wurde von RLS und JK verfasst. Alle Autoren haben das endgültige Manuskript gelesen und genehmigt.

Korrespondenz mit Ashutosh K. Mangalam.

AKM ist einer der Erfinder einer Technologie, die den Einsatz von Prevotella histicola zur Behandlung von Autoimmunerkrankungen vorsieht. AKM erhielt Lizenzgebühren von der Mayo Clinic (bezahlt von Evelo Biosciences). In der vorliegenden Studie wurden jedoch keine Mittel oder Produkte aus dem Patent verwendet. Alle anderen Autoren erklären, dass keine kommerziellen oder finanziellen Beziehungen bestehen, die einen potenziellen Interessenkonflikt darstellen könnten.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Shrode, RL, Knobbe, JE, Cady, N. et al. Bei Brustkrebspatientinnen aus dem Mittleren Westen der USA ist die Konzentration kurzkettiger Fettsäuren produzierender Darmbakterien verringert. Sci Rep 13, 526 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-27436-3

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Eingegangen: 18. Oktober 2022

Angenommen: 02. Januar 2023

Veröffentlicht: 11. Januar 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-27436-3

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Bei Brustkrebspatientinnen aus der Region Mittlerer Westen der USA ist die Zahl der Brustkrebserkrankungen reduziert